[發明專利]氣相色譜-質譜檢測細胞內中糖、氨基酸的方法

無效

• 申請號: 201310649126.7
• 申請日: 2013-12-05
• 公開（公告）號: CN103675180A
• 公開（公告）日: 2014-03-26
• 發明（設計）人: 陳東
• 申請（專利權）人: 陳東
• 主分類號: G01N30/88
• 分類號: G01N30/88;G01N30/06
• 代理公司: 廣西南寧匯博專利代理有限公司 45114
• 代理人: 鄧曉安

1.一種氣相色譜-質譜檢測細胞內糖、氨基酸的方法，其特征在于，檢測方法步驟包括：

（1）取發酵液，高速離心，分別收集菌體和上清液Ⅰ；

（2）細胞內代謝物樣品制備：取步驟1）得到的菌體，用生理鹽水清洗2~3次，冷甲醇溶解后超聲破碎至細胞裂解，得到裂解液，低溫萃取裂解液，離心收集50~200ul萃取后裂解上清液Ⅱ，加入內標物核糖醇溶液，裂解上清液Ⅱ體積與內標物核糖醇重量比例為50~200ul:20μg，室溫真空烘干，得到細胞內代謝物樣品Ⅰ；

（3）樣品衍生：在步驟2）得到的樣品Ⅰ中，分別加入50~150ul糖衍生劑，恒溫放置1.5~4h，再分別加入50~150ul氨基酸衍生劑，恒溫放置過夜，衍生完畢，離心衍生后的樣品Ⅰ，收集上清得到待測胞內樣品Ⅰ；

（4）利用氣相色譜-質譜對步驟3）得到的待測胞內樣品Ⅰ，進行分析和數據采集。

2.根據權利要求1所述的一種氣相色譜-質譜檢測細胞內糖、氨基酸的方法，其特征在于，所述菌體其取樣量為用冷甲醇溶解后生物量干重達0.2~1.0g/ml；所述的冷甲醇為經過冷浴槽預冷至-40℃；所述低溫萃取為-40℃至-50℃下萃取2~7h。

3.根據權利要求1或2所述的一種氣相色譜-質譜檢測細胞內糖、氨基酸的方法，其特征在于，所述糖衍生劑為0.1~0.3mg甲氧胺鹽酸溶于10ml吡啶溶液中配制而得；所述氨基酸衍生劑為50~200ul三甲基氯硅烷溶于10ml的三氟乙酰胺中。

4.根據權利要求3所述的一種氣相色譜-質譜檢測細胞內糖、氨基酸的方法，其特征在于，所述氣相色譜-質譜其儀器分析條件為：氣相色譜：色譜柱為30?m×0.25?mm的HP-5MS或者DB-5MS毛細管柱，進樣口溫度300℃，檢測器溫度250℃，柱箱升溫程序平衡時間3?min→80℃維持1min?→2℃/min升溫至100℃→15℃/min升溫至220℃→30℃/min升溫至300℃→300℃維持3?min，進樣體積1μL；質譜：離子源EI，檢測器為四級桿，電離能70?eV，離子源表面溫度280℃。

5.根據權利要求4所述一種氣相色譜-質譜檢測細胞內糖、氨基酸的方法，其特征在于，該方法應用于檢測酵母菌、乳酸菌、梭菌、霉菌的生物發酵過程中的細胞內的糖、氨基酸。

6.根據權利要求1~2或4~5任一項所述的一種氣相色譜-質譜檢測細胞內糖、氨基酸的方法，其特征在于，所述糖為葡萄糖、果糖、木糖；所述氨基酸為為谷氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸、賴氨酸、丙氨酸、組氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、天門冬氨酸、天門冬酰胺、酪氨酸、脯氨酸。

7.根據權利要求3所述的一種氣相色譜-質譜檢測細胞內糖、氨基酸的方法，其特征在于，所述糖為葡萄糖、果糖、木糖；所述氨基酸為為谷氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸、賴氨酸、丙氨酸、組氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、天門冬氨酸、天門冬酰胺、酪氨酸、脯氨酸。