[發明專利]一種內切葡聚糖酶及其應用

有效

• 申請號: 201310647566.9
• 申請日: 2013-12-04
• 公開（公告）號: CN103725660A
• 公開（公告）日: 2014-04-16
• 發明（設計）人: 李佩佩;張青;王華明;黃亦鈞
• 申請（專利權）人: 青島蔚藍生物集團有限公司
• 主分類號: C12N9/42
• 分類號: C12N9/42;C12N15/56;D06M16/00;C12R1/80
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

?技術領域

本發明屬于微生物工程技術領域，具體涉及一種內切葡聚糖酶及其應用。

背景技術

纖維素酶是一類能夠降解纖維素，使之生成纖維二糖、葡萄糖等一系列酶的總稱，按各酶功能的不同可以分為內切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶。纖維素被它降解后可轉化為人類急需的能源、食物、化工原料，對于人類社會解決食物短缺和能源危機具有重大的現實意義。

纖維素廣泛存在于自然界的生物體中，細菌、真菌、動物體內等都能產生纖維素酶。一般用于生產的纖維素酶來自于真菌，比較典型的是木霉屬、曲霉屬和青霉屬。

纖維素酶成本高以及酶活力低已經成為制約纖維素酶廣泛應用的兩大瓶頸，因此構建高效表達的基因工程菌是降低纖維素酶成本、提高產量的有效手段。

發明內容

本發明提供了一種新型內切葡聚糖酶及其在紡織領域的應用。本發明通過構建含有草酸青霉（Penicillium?oxalicum）的內切葡聚糖酶基因的表達質粒，轉化入黑曲霉中，獲得高效重組表達內切葡聚糖酶的黑曲霉工程菌株，從而彌補現有技術的不足。

本發明一方面涉及一種內切葡聚糖酶，包括：

（a）其氨基酸序列為SEQ?ID?NO:1的內切葡聚糖酶；

（b）在（a）中的氨基酸上發生取代、缺失或添加一個或數個氨基酸得到的，具有內切葡聚糖酶活性的酶。

編碼上述內切葡聚糖酶的基因，其一種編碼核苷酸序列為SEQ?ID?NO:?2。

本發明另一方面涉及上述內切葡聚糖酶在紡織領域中的應用。

本發明提供的新型內切葡聚糖酶來源于草酸青霉，構建的黑曲霉工程菌能高效表達該酶，搖瓶發酵酶活可達900U/mL；本發明獲得的重組內切葡聚糖酶的最適作用pH為4.0，最適溫度為45℃，在pH5.0-7.0范圍內酶活損失不高于5%，可廣泛應用于紡織加工技術領域。在針織面料、梭織面料的除毛染色方面，應用本發明的重組內切葡聚糖酶具有除毛干凈，對織物強力損失小的特點，有利于其推廣應用。

附圖說明

圖1?為黑曲霉EG-1發酵上清液SDS-PAGE電泳檢測分析圖，其中泳道1為對照組，泳道2為黑曲霉EG-1發酵上清液，箭頭所指處即為重組表達的內切葡聚糖酶。

具體實施方式

本發明用到了遺傳工程和分子生物學領域使用的常規技術和方法，例如MOLECULAR?CLONING:?A?LABORATORY?MANUAL,?3nd?Ed.?(Sambrook,?2001)和CURRENT?PROTOCOLS?IN?MOLECULAR?BIOLOGY?(Ausubel,?2003)中所記載的方法。這些一般性參考文獻提供了本領域技術人員已知的定義和方法。但是，這并不意味著將本發明限定于所述的任何具體方法、實驗方案和試劑，因為它們可以改變。

除非在本文中另作限定，本文所用的全部技術術語和科學術語具有本發明所屬領域的普通計數人員通常所理解的相同含義。DICTIONARY?OF?MICROBIOLOGY?AND?MOLECULAR?BIOLOGY,?3nd?Ed.?(Singleton?et?al.,?2006)和COLLINS?DICTIONARY?BIOLOGY?(Hale?et?al.,?2003)為技術人員提供了本發明中所使用的許多術語的一般性解釋。

????下面結合具體實施例對本發明進行詳細的描述。

實施例1?內切葡聚糖酶基因的克隆

1.1??草酸青霉總DNA的提取

將草酸青霉（Penicillium?oxalicum）過夜培養，取適量菌體置于離心管中，13000?rpm離心5?min，棄上清；加入400μl抽提緩沖液(100?mM?Tris-HCl,?100?mM?EDTA,?250?mM?NaCl,?1%SDS);?然后加100mg石英砂或玻璃珠，在珠打儀劇烈振蕩2min左右；65℃水浴20min后，加入200μl?10M?NH₄AC，冰浴10min；13000rpm離心10min，取上清；加入2倍體積的無水乙醇，-20℃放置30min；13000?rpm離心10min，棄上清；用70%乙醇洗滌2次；晾干，加入水溶解，于-20℃保存。利用OMEGA公司的E.Z.N.A.?Fungal?RNA?Kit制備草酸青霉的mRNA，其制備過程參照試劑盒的操作手冊。

1.2?基因克隆