[發明專利]一種植物中期染色體表觀基因組核型的分析方法

無效

• 申請號: 201310647518.X
• 申請日: 2013-12-06
• 公開（公告）號: CN103614480A
• 公開（公告）日: 2014-03-05
• 發明（設計）人: 李立家;何世斌;顏識涵;王璞;王翔伍
• 申請（專利權）人: 武漢大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 武漢科皓知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 42222
• 代理人: 張火春

技術領域

本發明涉及一種植物中期染色體表觀基因組核型的分析方法，屬于分子細胞遺傳學領域。

技術背景

繪制各類真核生物的表觀基因組圖譜的工作正在進行，這通常包括各種修飾的組蛋白、非組蛋白或DNA甲基化在基因組上的分布，并將這些修飾與基因組功能相聯系。表觀基因組的全基因組分析可以在分子水平上通過染色質免疫沉淀偶聯DNA測序技術(Chromatin?immunoprecitation-sequencing，?ChIP-seq)或結合DNA微陣列技術(ChIP-chip)得到揭示。但真核生物基因組中含有大量的重復序列會阻礙基因組測序分析，并且這種技術不能辨別處在細胞周期不同階段的細胞，這樣獲得的數據代表一些基因不同表達模式的細胞群體或處于不同細胞周期的細胞群體所產生的平均值。這種細胞間的異質性必然會限制關聯染色質功能與組蛋白修飾的精確性，而且這些技術只能應用于已經測序或者已經有芯片開發的物種。

現在這些問題可通過免疫染色技術來檢測單細胞水平的表觀修飾的分布情況來解決。在有絲分裂中期很少或幾乎沒有轉錄，這樣消除了細胞間的差異性，細胞間的免疫標記一致性也可以重復分析。免疫中期染色體能在單細胞中分析整個表觀基因組，包括難以用基于測序方法達到的重復序列富集的區域，并且結合4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)染色/熒光原位雜交技術(Fluorescence?in?situ?hybridization，FISH)技術能識別單個染色體/某些染色質區域的表觀修飾情況。盡管染色體顯微技術比Chip-seq技術的分子分辨率低，但是它將提供一種有價值的表觀圖譜的補充方法和途徑，兩者相互補充。用表觀修飾抗體進行的中期染色體免疫標記能夠在顯微鏡下觀察和研究亞細胞核結構和染色體水平的表觀修飾分布，這也被稱為表觀基因組核型(Genome?Biol.?2010，11，R110)。

植物染色體由于與動物染色體結構的差異，植物中一些顯帶技術并沒有產生很好的帶型，一些緊密相鄰的多條熒光帶不能分辨出來。因此，用表觀修飾的抗體進行免疫標記時只能觀察到大致的分布趨勢，并沒有像動物中呈現出帶紋。借助計算機進行的圖像處理與分析技術的發展，尤其是反卷積圖像復原技術為我們完善顯帶技術并在植物中獲得清晰的帶紋提供了機會(Chromosoma?2004，113,16)。圖像模糊是由于光學顯微系統中點擴散函數(point?spread?function，PSF)造成的，反卷積圖像復原技術是以這個概念為基礎，運用反卷積算法，對所得到的比較模糊的圖像進行復原，能夠顯著提高寬場熒光顯微鏡所得圖像的分辨率。因此如果能將反卷積圖像復原技術運用于植物中期染色體表觀基因組核型分析中，可以清晰地得到植物中表觀修飾標記的信號模式以及染色質結構和功能。

發明內容

本發明所要解決的技術問題在于提供一種植物中期染色體表觀基因組核型的分析方法，該方法能夠顯著提高寬場熒光顯微鏡所得圖像的分辨率，在植物中期染色體中獲得清晰的帶紋，本方法操作簡單、方便易行。

本發明提供的植物中期染色體表觀基因組核型的分析方法，包括如下步驟：

制備植物中期染色體；使用不同的表觀修飾抗體，進行傳統的免疫染色實驗；拍照，圖像處理；然后進行熒光原位雜交實驗，利用不同的探針進行染色體的識別。

所述免疫染色實驗拍照以及圖像處理具體包括如下步驟：首先通過測量染色體的高度，設置步長，通過控制Z軸步進器，對染色體逐層掃描，采集到一組二維圖像，用Metamorph軟件的No?Neighbors?deconvolution程序，對這組圖像進行反卷積處理，去模糊復原，接著用Meta?morph軟件的3D?Reconstruction，對這些復原的圖像沿Z軸進行三維重建，這樣更反映了染色體表觀帶紋的真實形態。顯微鏡鏡頭的點擴散函數通常由激發光波長、鏡頭數值孔徑、圖像像素距離、介質折射率等決定。其中，圖像像素距離和介質折射率是顯微鏡中固定的數值。一般Olympus?100×鏡頭數值孔徑為1.35，然后根據樣品中所用的熒光染料的激發光波長來進行設置，處理DAPI染色形成的圖像時激發光波長設為488?nm，FITC的為520?nm。然后再根據染色體的厚度，染色的深淺，信號的強弱，曝光時間的長短等其他因素來進一步調整程序中的一些參數，進行反卷積處理。

本發明與現有技術相比具有以下有益效果：?