[發明專利]一種分泌表達屋塵螨過敏原Derp2的重組乳酸乳球菌及其應用

在審

• 申請號: 201310646556.3
• 申請日: 2013-12-04
• 公開（公告）號: CN103642815A
• 公開（公告）日: 2014-03-19
• 發明（設計）人: 陳衛;張秋香;艾春青;王剛;田豐偉;劉小鳴;趙國忠;趙建新;張灝;郭敏
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N1/21;C12N15/74;A61K48/00;A61K39/35;A61P37/08;C12R1/01
• 代理公司: 北京君智知識產權代理事務所 11305
• 代理人: 呂世靜

背景技術

過敏性疾病是臨床上的常見病、多發病，是當前世界性的重大衛生學問題。其中，在引發過敏性疾病的眾多吸入性過敏原中，塵螨是導致呼吸道變態反應性疾病的重要因素之一。塵螨是一類結構和成分復雜的生物，目前人們已從塵螨的數百種蛋白中初步鑒定出幾十種過敏原；過敏原Derp2是其中最為主要的過敏原之一，約80%-90%的塵螨過敏患者對Derp2產生過敏反應。特異性免疫治療（SIT）被認為是最有效的治療過敏的方法，但成功的免疫治療取決于高質量的變應原。目前，臨床上用于診斷和治療的塵螨粗提液含有大量非特異性雜質，嚴重阻礙了塵螨過敏原試劑的臨床應用。為獲得高質量的變應原，從天然產物中分離純化過敏原（專利申請號：200410022961.9），操作繁復且純度不高，重復性較差；利用分子生物學技術，在大腸桿菌（專利申請號：201210139240.0）、酵母等表達系統中表達過敏原Derp2被認為是一種可行的策略，但其安全性及后續過敏原的純化限制了這些表達系統的實際應用。

近幾年，隨著對乳酸菌性質的不斷研究，其益生特性逐漸被人們所認識并接受，特別是在治療一些慢性疾病和自身免疫性疾病，如過敏，腸炎等，具有普通藥物所不具備的優勢。以乳酸菌作為表達系統，使抗原或其他功能性蛋白在粘膜表面進行表達釋放，可以有效的避免傳統表達系統（大腸桿菌）所帶來的安全隱患及后續抗原的純化問題，同時避免了在口服過程中蛋白的降解和口服耐受，更能促進抗原或功能性蛋白被免疫系統所吸收等。

外源蛋白在乳酸菌中的表達方式有三種，其中在信號肽作用下將目的蛋白分泌到培養基中是最為主要的一種方式。多項實驗結果表明乳酸菌以分泌表達的形式在腸道粘膜表面表達功能性蛋白分子（如IL-10,IL-12）可以起到非常明顯的治療效果。此外，抗原蛋白（如花粉、人乳頭狀瘤病毒等）在乳酸菌內的分泌表達可以起到明顯的預防疾病發生的作用。本實驗為使塵螨過敏原Derp2在乳酸乳球菌內高效表達并發揮較好的預防效果，我們對Derp2的天然基因進行了密碼子優化，并構建了分泌表達過敏原Derp2重組乳酸乳球菌L.lactis?SD；同時通過動物實驗對其預防塵螨過敏疾病的效果進行了研究。

發明內容

本發明的目的在于提供一種基因優化的屋塵螨過敏原Derp2，提供一種分泌表達基因優化后的塵螨過敏原Derp2的重組乳酸乳球菌L.lactis?SD（保藏號為CGMCC?No.8223），提供將所述過敏原用于預防屋塵螨過敏疾病的用途，提供將所述重組乳酸乳球菌用于預防塵螨過敏疾病的用途。

一方面，本發明提供了一種基因優化的屋塵螨過敏原Derp2，該過敏原基因mderp2的序列為SEQ?ID?No.1。

所述的基因優化的屋塵螨過敏原Derp2基因是通過對來源于屋塵螨（Dermatophagoides?pteronyssinus）的主要過敏原Derp2的天然基因序列SEQ?ID?No.2進行基因優化后獲得的。

另一方面，本發明提供了一種分泌表達基因優化的屋塵螨過敏原Derp2的重組乳酸乳球菌L.lactis?SD（保藏號為CGMCC?No.8223），所述菌株是通過將優化后的基因mderp2克隆到乳酸乳球菌的表達質粒pNZ8148上，構建分泌表達型質粒pNZ8148-SD，再將獲得的分泌表達型質粒電轉入宿主菌株L.lactis?NZ9000而獲得的。

另一方面，本發明提供了將所述過敏原用于預防屋塵螨過敏疾病的用途。

再一方面，本發明提供了將上述菌株用于預防塵螨過敏疾病的用途。

本發明涉及的一種分泌表達基因優化的屋塵螨過敏原Derp2的重組乳酸乳球菌L.lactis?SD，于2013年9月18日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，保藏編號為CGMCC?No.8223。

附圖說明

圖1表示屋塵螨過敏原Derp2基因突變位點對照圖。

圖2表示重組乳酸乳球菌中Derp2蛋白的Western?blot檢測。

如圖：最左側為蛋白分子Marker；1號泳道：純化的Derp2，用作陽性對照；2號泳道：重組菌株L.lactis?SD培養液上清；3號泳道和4號泳道：分別是對照菌株L.lactis8148（不含Derp2的基因序列）培養基上清和細胞破碎液

圖3表示小鼠免疫的過程。