[發明專利]小麥-濱麥3D（3Ns）異代換系的培育方法和鑒定方法

無效

• 申請號: 201310646553.X
• 申請日: 2013-12-02
• 公開（公告）號: CN103688846A
• 公開（公告）日: 2014-04-02
• 發明（設計）人: 趙繼新;龐玉輝;陳新宏;武軍;程雪妮;楊群慧
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學
• 主分類號: A01H1/02
• 分類號: A01H1/02;A01H1/04;C12Q1/68
• 代理公司: 北京方圓嘉禾知識產權代理有限公司 11385
• 代理人: 董芙蓉

1.小麥-濱麥3D(3Ns)異代換系的培育方法，其特征在于包括下述步驟：1)四倍體硬粒小麥與八倍體小濱麥雜交，在各世代均進行鑒定，篩選出染色體數目為2n＝42，且含有濱麥Ns基因組染色體的單株；2)篩選出的單株均套袋自交，在F5世代，選育出含有2條濱麥Ns染色體的小麥-濱麥3D(3Ns)異代換系。

2.根據權利要求1所述的培育方法，其特征在于所述四倍體硬粒小麥品種為D4286，八倍體小濱麥品種為M842-16。

3.根據權利要求1所述的培育方法，其特征在于所得小麥-濱麥3D(3Ns)異代換系的染色體構型為2n＝42＝21II，染色體組成為由40條小麥染色體和2條濱麥Ns染色體構成，濱麥的2條Ns染色體配對為1個二價體染色體。

4.小麥-濱麥3D(3Ns)異代換系的鑒定方法，其特征在于采用細胞遺傳學分析方法：將F5后代小濱麥3D(3Ns)異代換系種子室內發芽，剪取根尖于冰水預處理24h，卡諾固定液固定，1％纖維素酶+1％果膠酶酶解，醋酸洋紅染色壓片；花粉母細胞觀察：田間取適齡幼穗，用卡諾固定液固定，醋酸洋紅染色壓片，顯微鏡觀察。

5.小麥-濱麥3D(3Ns)異代換系的鑒定方法，其特征在于采用基因組原位雜交(GISH)方法：采用CTAB法提取濱麥和華山新麥草全基因組DNA并進行標記，染色體制片及原位雜交，每張制片加40μl雜交液，然后95℃變性8min，雜交在原位雜交儀上依照程序進行。

6.小麥-濱麥3D(3Ns)異代換系的鑒定方法，其特征在于采用重復序列(pAs1)熒光原位雜交(FISH)方法：采用缺刻平移法對重復序列pAs1進行標記，然后進行熒光原位雜交(FISH)，每張制片加40μl雜交液，然后95℃變性8min，雜交在原位雜交儀上依照程序進行。

7.根據權利要求5或6所述的小麥-濱麥3D(3Ns)異代換系的鑒定方法，其特征在于所述雜交液組成為：20×SSC4μl，ssDNA(鮭魚精DNA，5ug/uL)1μl，10％(W/V)SDS1μl，50％(W/V)DS8μl，去離子甲酰胺20μl，探針DNA或pAs1探針DNA100ng，無菌去離子水加至40μl。

8.根據權利要求5或6所述的小麥-濱麥3D(3Ns)異代換系的鑒定方法，其特征在于所用原位雜交儀為HYBrite原位雜交儀，程序設置為75℃8min，37℃16h。

9.小麥-濱麥3D(3Ns)異代換系的鑒定方法，其特征在于采用SSR和EST-STS標記分析方法：采用小麥D基因組1D～7D染色體的14對SSR引物，對F5后代小濱麥3D(3Ns)異代換系及其親本進行分析，確定D基因組染色體的組成；采用小麥1-7同源群染色體的14對EST-STS引物，確定Ns基因組染色體的同源群歸屬；采用PCR擴增反應對DNA進行擴增，擴增產物經8％非變性聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，點樣量8μl，150V恒壓條件下電泳4～5h，硝酸銀染色。

10.根據權利要求11所述的鑒定方法，其特征在于所述PCR擴增反應的反應體系為包含1×buffer(100mM?Tris-HCl?pH8.3，1.5mM?MgCl₂)，0.2M?dNTPs，50ng引物，1U?Taq?DNA聚合酶，50～100ng模板DNA，反應條件為94℃預變性3min，34個循環按照94℃變性1min，50，55或60℃退火1min，72℃延伸2min進行，最后充分延伸10min。