[發明專利]一種提取食用菌DNA的方法

無效

• 申請號: 201310646321.4
• 申請日: 2013-12-04
• 公開（公告）號: CN103627702A
• 公開（公告）日: 2014-03-12
• 發明（設計）人: 章爐軍;尚曉冬;巫萍;譚琦;宋春艷;張丹;于海龍
• 申請（專利權）人: 上海市農業科學院
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 上海申新律師事務所 31272
• 代理人: 劉懿

技術領域

本發明涉及食用菌基因工程領域，具體的說涉及一種提取食用菌DNA的方法。

背景技術

近年來，我國食用菌產業迅速發展，食用菌相關的基礎研究也已經深入到分子水平，食用菌的分類，遺傳，育種，菌種鑒定，遺傳多樣性等的研究中都需要提取或制備DNA，這些DNA運用到基因組測序，某個基因或片段的PCR擴增，DNA分子標記應用以及基因工程的研究中，在這些研究中制備的DNA有很大一部分比例都用于各種PCR反應。

目前，各種食用菌DNA的提取方法主要在破壁方法，雜質去除以及核酸沉淀上存在差異。通常采取的破壁方法，包括液氮研磨，石英砂研磨或玻璃珠震蕩等，再加入十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）或氯化芐等處理，經過酚—氯仿抽提去雜質，最后用乙醇或異戊醇沉淀核酸。CTAB法作為最常用的食用菌DNA提取方法，利用CTAB這種陽離子去污劑在高鹽濃度（>0.7mol/L?NaCl）下能與蛋白質和多聚糖形成復合物，但不沉淀核酸的特性，再通過有機溶劑抽提，去除溶液中蛋白，多糖，酚類等雜質，最后通過加入乙醇沉淀核酸的過程。整個提取過程步驟繁瑣，耗費大量時間和費用，雖有一些簡化方法，但不是增加成本就是需要其他試驗工具輔助。總之，目前的食用菌DNA提取方法普遍存在步驟繁瑣，提取時間長，提取成本高等不足之處，沒有一種的能僅用一種簡單的試劑，僅用簡單的操作就能完成的DNA制備方法。

發明內容

本發明的目的是提供一種提取食用菌DNA的方法，該方法包括以下步驟：

（1）取材：將食用菌菌絲置于緩沖液中；

（2）加熱：90-110℃加熱；

（3）離心：7000-9000rpm離心5-10min后吸取上清液，上清液中即含有總DNA。

其中步驟（2）中優選的加熱溫度為95-100℃。

其中第（1）步取材，具體的說為：食用菌菌絲為PDA平板上培養生長1～3天的幼嫩氣生菌絲，滅菌牙簽在平板表面刮取2～3次，至牙簽頭部有肉眼可見的小團菌絲，刮取的菌絲重量接近0.001g。在200μL小離心管中預先加入200μL?TE緩沖液（10mmol/L?Tris-HCl，1mmol/L?EDTA，pH8.0），將帶有菌絲的牙簽置于緩沖液中攪動，至菌絲全部分散在離心管中。

上述第（2）步中，可用PCR儀或水浴調節溫度為90-110℃，離心管置于其中保持10min。

上述第（3）步中，經過8000rpm離心后，菌絲處于離心管底部，上清液中即含有總DNA。

用上述方法制備得到的含有總DNA的上清液，可吸取后直接用于PCR反應，不需要再進行稀釋，非常便利。

所述食用菌包括香菇，平菇，金針菇，雙孢蘑菇，黑木耳，灰樹花等。

所述PCR反應，包括確定片段的PCR反應，如ITS片段擴增；多種分子標記擴增，如RAPD，SSR，ISSR，SRAP。

本發明以食用菌幼嫩菌絲體為材料快速制備適于PCR反應的總DNA，該方法的優點如下：

（1）所需材料獲取簡單、量少，僅需肉眼可見的小團菌絲，可于平板表面或試管斜面刮取，根據不同食用菌品種的生長速度，僅需培養1～3天即可獲得試驗所需的菌絲量。

（2）該方法無需液氮研磨或其他物理破壁過程，減少了試驗工作量。

（3）該方法無需多種試劑多步驟抽提，降低了試驗成本和試驗繁瑣程度。

（4）該方法制備速度極快，整個制備過程可控制在15min內，并可同時制備大量樣品。

（5）該方法制備的DNA含量和純度達到多種PCR反應的要求，DNA完整性優于CTAB提取法，且提取的DNA量可完成100次以上的常規PCR反應。

總之，本發明的一種提取食用菌DNA的方法，操作簡單、用時短、成本低、對環境無污染，制備的DNA完整性好，質量穩定，適于PCR反應。

附圖說明

圖1.PCR反應的擴增效果比較

其中A、B、C、D、E分別為RAPD、SSR、ISSR、SRAP和ITS擴增效果比較，M為Marker，C為CTAB法提取的香菇DNA對照，L為實施例一提取的香菇DNA

具體實施方式

下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。