[發明專利]干擾EV71病毒2A蛋白酶基因的三個siRNA及其應用

無效

• 申請號: 201310646161.3
• 申請日: 2013-12-06
• 公開（公告）號: CN103642808A
• 公開（公告）日: 2014-03-19
• 發明（設計）人: 陳建國;劉海冰;王勝軍;孔枕枕;趙培培
• 申請（專利權）人: 陳建國;劉海冰
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;A61K48/00;A61P31/14
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及的是干擾EV71病毒2A蛋白酶基因的三個siRNA及其應用，包括stealth?siRNA-69stealth?siRNA-294stealth?siRNA-319。

背景技術

EV71病毒屬于微小RNA病毒科腸道病毒A組，病毒基因組為單股正鏈RNA，大小約7500bp，病毒衣殼為二十面體立體對稱球形結構，直徑約為24-30nm，無包膜和突出。EV71感染主要引起手足口病，多發生于學齡前兒童，其臨床癥狀主要表現為發熱，手、足、口腔黏膜等部位出現皰疹，重癥病例在發病1-5天后出現腦膜炎、腦炎、腦脊髓炎、肺水腫和循環障礙等癥狀，甚至死亡。1957年，加拿大首次報告手足口病，之后在歐洲、美洲和亞洲多個地區相繼發生大流行。在我國，手足口病早有流行。1981年，上海首次報告了手足口病，2008年3月，安徽省阜陽市發生了較大規模的疫情，感染人數達176000人，并有23例死亡，隨即在全國其他地區也出現了手足口病的疫情，引起了社會的恐慌。目前，尚無有效抵抗EV71的抗病毒藥物，所以，尋找一種潛在有效的抗病毒方法是十分必要的。

RNA干擾是一種分子生物學上由雙鏈RNA誘發的基因沉默現象，其機制是通過阻礙特定基因的翻譯或轉錄來抑制基因表達。當細胞中導入與內源性mRNA編碼區同源的雙鏈RNA時，該mRNA發生降解而導致基因表達沉默。研究中導入的雙鏈RNA分子為具有基因沉默功能的大小約21-25核苷酸的雙鏈小RNA分子(稱為siRNA)，由RNAaseIII家族中對雙鏈RNA具有特異性的酶Dicer加工而成。

近些年已經報道過以EV71基因的其他區域比如vp1，vp2，5’UTR，3’UTR，2C，3Cpro?and3Dpol為靶序列化學合成siRNR治療病毒的文章，但還沒有以2A蛋白酶基因作為抑制病毒復制的靶標，所以本發明的目的是探討以EV712A蛋白酶基因為靶序列化學合成的三個siRNA是否具有潛在的抗病毒作用。

因此，現有技術存在缺陷，需要改進。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是針對現有技術的不足提供干擾EV71病毒2A蛋白酶基因的三個siRNA及其應用。

本發明的技術方案如下：

干擾EV71病毒2A蛋白酶基因的三個siRNA，包括如下表所示的三個siRNA：stealth?siRNA-69、stealth?siRNA-294、stealth?siRNA-319：

所述的三個siRNA的應用，其與EV71病毒2A蛋白酶基因區域有效的互補結合，將病毒核酸降解，從而達到抑制病毒復制擴增的目的。

stealth?siRNA-69，stealth?siRNA-294，stealth?siRNA-319是以EV712A蛋白酶基因為靶序列化學合成的三個siRNA，其可以與EV71病毒2A蛋白酶基因區域有效的互補結合，將病毒核酸降解，從而達到抑制病毒復制擴增的目的。以siRNA為基礎的RNAi因其基因沉默的高度特異性和高效性，為病毒感染類疾病的臨床治療開辟了新的途徑。

附圖說明

圖1為stealth?siRNA抗病毒作用的檢測結果；stealth?siRNA抑制病毒RNA亂序siRNA作為陰性對照；模擬轉染處理組為只用Lipo2000處理；僅病毒為只用病毒感染。三次獨立實驗數據用means±SD表示(**p<0.01)。

圖2為stealth?siRNA抑制病毒蛋白表達；actin作為內參對照。

具體實施方式

以下結合具體實施例，對本發明進行詳細說明。

1stealth?siRNA的合成

在NCBI網站搜索EV712A蛋白酶基因序列(JN001860.1)，以此序列為靶目標由上海英駿公司化學合成三個siRNA,其作用原理為stealth?siRNA轉染進細胞后，結合一個核酶復合物從而形成RNA誘導的沉默復合物(RISC)，隨后雙鏈stealth?siRNA在酶的作用下被分解成單鏈形成激活的RISC，激活的RISC通過堿基配對定位到同源的mRNA上，并在距離siRNA3’端12個堿基的位置切割靶mRNA,從而抑制mRNA的翻譯。其序列見下表1。

表1三個stealth?siRNA分子的相關序列與其在2A蛋白酶基因的位點

2stealth?siRNA轉染RD細胞及病毒感染