[發明專利]氣相色譜-質譜檢測細胞內外液中氨基酸的方法

無效

• 申請號: 201310645462.4
• 申請日: 2013-12-05
• 公開（公告）號: CN103675128A
• 公開（公告）日: 2014-03-26
• 發明（設計）人: 陳東
• 申請（專利權）人: 陳東
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02
• 代理公司: 廣西南寧匯博專利代理有限公司 45114
• 代理人: 鄧曉安

技術領域

本發明屬于生物化學檢驗測定技術領域，特別是涉及一種氣相色譜-質譜檢測細胞內外液中氨基酸的方法。

背景技術

在利用氣相色譜-質譜檢測有機酸代謝物方面，目前已有相關技術報道，如專利201210046953.2，公布了一種氣相色譜－質譜檢測尿糖的方法，包括如下步驟：（1）對待檢尿液樣本完成尿酶處理；（2）加入內標品，采用冷凍乙醇進行沉淀蛋白的處理，將樣本吹干；（3）對上述樣本進行甲基硅烷化衍生處理；（4）采用上述1-3的步驟處理標準糖，得到標準糖樣本；（5）采用氣相色譜－質譜聯用儀對標準糖樣本和待檢尿液樣本進行檢測；（6）以標準糖樣本的檢測結果作為參比曲線，用常規算法對待檢尿液樣本的糖進行定量。該專利發明主要應用領域為尿樣檢測，且該檢測方法僅局限于糖代謝物的檢測。

對于發酵液中微生物胞內、胞外代謝物的檢測研究，可以揭示微生物在發酵條件下的代謝規律，尤其是發酵條件對于微生物目標產物的影響規律。掌握微生物的代謝規律可以不僅有利的促進目標產物的產量提升，而且可確定菌體內的代謝通量分布，進而利用基因工程手段實現菌體內代謝途徑的優化與重構，實現目標產物高效生物合成。

目前對于發酵液中的代謝物分析檢測方法局限用于特定某類物質，不可實現多類代謝物同時檢測。由于發酵液中各成分含量復雜多樣，對于樣品的處理方法很關鍵，目前還沒有相關發酵液中細胞內、細胞外代謝物的系統處理檢測方法，使得開發一種更為靈敏的、廣譜的、通用的發酵代謝物檢測方法，鑒定各種譜峰對映的化合物結構，以及與其它虛擬模型的整合，成為微生物代謝組研究的熱點。

發明內容

本發明的目的是提供一種氣相色譜-質譜檢測細胞內外液中氨基酸的方法，彌補目前在微生物發酵中對代謝物系統檢測方法的空白，克服現有檢測技術干擾因素很多、操作繁瑣、測試成本高、靈敏度低、檢測范圍窄等缺點。

本發明的方案是通過這樣實現的：一種氣相色譜-質譜檢測細胞內外液中氨基酸的方法，其特征在于，檢測方法步驟包括：

（1）取發酵液，高速離心，分別收集菌體和上清液Ⅰ。

（2）細胞內代謝物樣品制備：取步驟1）得到的菌體，用生理鹽水清洗2~3次，冷甲醇溶解后超聲破碎至細胞裂解，得到裂解液，低溫萃取裂解液，離心收集50~200ul萃取后裂解上清液Ⅱ，加入內標物核糖醇溶液，裂解上清液Ⅱ體積與內標物核糖醇重量比例為50~200ul:20μg，室溫真空烘干，得到細胞內代謝物樣品Ⅰ。

（3）細胞外液樣品制備：取60~350ul步驟1）得到的上清液Ⅰ，在清液Ⅰ中加入乙腈除去蛋白，上清液Ⅰ與乙腈體積比為1:0.5~1.5，渦旋振蕩，再離心收集上清液Ⅲ，加入內標物核糖醇溶液，上清液Ⅲ體積與內標物核糖醇重量比例為50~300ul：20μg，室溫真空烘干，得到細胞外液樣品Ⅱ。

（4）樣品衍生：在步驟2）和步驟3）得到的樣品Ⅰ和樣品Ⅱ中，分別加入50~150ul糖衍生劑，恒溫放置1.5~4h，再分別加入50~150ul氨基酸衍生劑，恒溫放置過夜，衍生完畢，

分別離心衍生后的樣品Ⅰ和樣品Ⅱ，對應收集各自上清得到待測胞內樣品Ⅰ和待測胞外樣品Ⅱ。

????（5）利用氣相色譜-質譜對步驟4）得到的待測胞內樣品Ⅰ和待測胞外樣品Ⅱ，分別進行分析和數據采集。

????作為本發明的進一步改進，所述菌體其取樣量為用冷甲醇溶解后生物量干重達0.2~1.0g/ml；所述的冷甲醇為經過冷浴槽預冷至-40℃；所述低溫萃取為-40℃至-50℃下萃取2~7h。

????作為本發明的進一步改進，所述糖衍生劑為0.1~0.3mg甲氧胺鹽酸溶于10ml吡啶溶液中配制而得；所述氨基酸衍生劑為50~200ul三甲基氯硅烷溶于10ml的三氟乙酰胺中。

作為本發明的進一步改進，所述氣相色譜-質譜其儀器分析條件為：氣相色譜：色譜柱為30?m×0.25?mm的HP-5MS或者DB-5MS毛細管柱，進樣口溫度300℃，檢測器溫度250℃，柱箱升溫程序平衡時間3?min→80℃維持1min?→2℃/min升溫至100℃→15℃/min升溫至220℃→30℃/min升溫至300℃→300℃維持3?min，進樣體積1μL；質譜：離子源EI，檢測器為四級桿，電離能70?eV，離子源表面溫度280℃。

作為本發明的進一步改進，該方法應用于檢測酵母菌、乳酸菌、梭菌、霉菌的生物發酵過程中的發酵液中細胞內外液的氨基酸。