[發明專利]一種流加油酸甲酯發酵生產達托霉素的方法

無效

• 申請號: 201310644851.5
• 申請日: 2013-12-05
• 公開（公告）號: CN103695510A
• 公開（公告）日: 2014-04-02
• 發明（設計）人: 朱輝;朱春燕;林億均
• 申請（專利權）人: 成都雅途生物技術有限公司
• 主分類號: C12P21/04
• 分類號: C12P21/04;C12R1/465
• 代理公司: 成都華典專利事務所(普通合伙) 51223
• 代理人: 徐豐;楊保剛

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技術領域

本發明屬于達托霉素的生產領域，尤其涉及一種流加油酸甲酯發酵生產達托霉素的方法。

背景技術

????近10年來，革蘭氏陽性耐藥菌感染的趨勢在不斷上升。目前臨床上治療細菌感染的難點主要集中于耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)，耐萬古霉素的腸球菌(VRE)，糖肽類敏感的金葡菌(GISA)?等，它們也是目前醫院中傳播率利致死率很高的病原體，雖然萬古霉素等糖肽類抗生素治療這類感染取得了一定療效，但近幾年來，臨床上已發現萬古霉素的耐藥菌，而且這種趨勢在逐漸增大。因此抗耐藥菌新抗生素的研究又成為熱門課題。達托霉素對以上耐藥菌均有很好的殺菌效果，且制劑用藥方便，毒副作用小，成為“病原菌最后一道防線——萬古霉素”的最佳替代品；更具意義的是，達托霉素作為環脂肽類抗生素家族的第一個產品，其化學結構和作用機制不同于已有所有類別的抗生素，是近四十年來繼口惡唑烷酮類抗生素后，應用到臨床的唯一新結構類別抗生素，而且達托霉素在臨床試驗中極少致使發生耐藥性分離株。

達托霉素(Daptomycin)?是一種從玫瑰孢鏈霉菌(Streptomyces?roseosporus)?發酵液分離得到的環脂肽類抗生素，其化學結構如式(I)?所示。從式(I)?可以看出，達托霉素由13?個氨基酸和1?個長鏈脂肪酸組成，其中10?個氨基酸組成一個氨基酸環，另有3?個氨基酸排列成線狀，并且在末端的L-?色氨酸(L-Trp)?上，連接1?個正癸酸。

達托霉素不僅具有新穎的化學結構，其作用模式也與任何現有上市的抗生素不同：達托霉素能擾亂細胞膜對氨基酸的轉運，從而阻礙細菌細胞壁肽聚糖的生物合成，改變細胞質膜的性質；另外，它還能通過破壞細菌的細胞膜，使其內容物外泄而達到殺菌的目的。達托霉素通過從多個方面破壞細菌細胞膜功能，能迅速殺死革蘭氏陽性菌，并且使細菌很難對其產生耐藥性(A.Raja?et?al.，Nature?Rev.Drug?Discov.，2003，2，943-944)。達托霉素除了能作用于大多數臨床相關革蘭氏陽性菌外，更重要的是，它在體外試驗中還對甲氧西林、萬古霉素和利奈唑烷等的耐藥分離菌株呈現出強力的活性。

達托霉素的合成方法有化學全合成、化學半合成和生物合成三種工藝，其中前二種由于工藝過程復雜且產率低尚無商業價值。目前，行業內生產達托霉素的常規方法主要是通過玫瑰孢鏈霉菌菌株發酵制得。

到目前為止，還尚未有有關在補料過程中單獨添加油酸甲酯從而提高達托霉素產量的報道。

發明內容

為解決上述問題，本發明采用如下技術方案：

一種流加油酸甲酯發酵生產達托霉素的方法，包括發酵培養，其特征在于：在發酵培養20h后，于每升發酵液中以1.5～3.0ml/h的流速往發酵罐中補料流加油酸甲酯溶液，直至發酵結束。

????優選地，所述油酸甲酯溶液的質量濃度為2.0％；所述油酸甲酯溶液的溶劑為乙醇和水按照1:20的體積比配成的混合液。

????本發明的有益效果如下：

拓寬發酵法生產達托霉素的路徑，油酸甲酯溶液對細胞的毒性較小，其在常溫下能夠以液體的形式存在，不會因溫度低而結晶，保障了流加的效果。此外，本發明不僅適用于實驗室小罐發酵達托霉素，也可在工業化大罐上進行放大生產。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發明進行詳細說明。以下實施例將有助于本領域的技術人員進一步理解本發明，但不以任何形式限制本發明。應當指出的是，對本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進。這些都屬于本發明的保護范圍。

實施例1

????一種流加油酸甲酯發酵生產達托霉素的方法，包括以下內容：

培養玫瑰孢鏈霉菌種子液；將種子液接種到發酵培養基中；然后進行培養和發酵，發酵培養溫度為30～32℃；當發酵培養20h以后，向發酵液中流加質量濃度為2.0％油酸甲酯溶液（溶劑為乙醇和水按照1:20的體積比配成的混合液），流加的速度為：每升發酵液中以1.5～3.0ml/h的流速往發酵罐中補料，直至發酵培養48～144h以后，結束發酵，將得到的發酵液進行提取分離，即得所述的達托霉素。

實施例2

????一種流加油酸甲酯發酵生產達托霉素的方法，包括以下內容：

????a.?培養玫瑰孢鏈霉菌種子液：將保藏的玫瑰孢鏈霉菌菌株轉接于斜面培養基上，30℃培養120h，然后接種于液體培養基中，在30℃的搖床中培養36h，即得所述的玫瑰孢鏈霉菌種子液。