[發(fā)明專利]發(fā)酵生產(chǎn)他克莫司的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310644714.1
• 申請日: 2013-12-05
• 公開（公告）號: CN103695496A
• 公開（公告）日: 2014-04-02
• 發(fā)明（設計）人: 朱輝;莫洪
• 申請（專利權）人: 成都雅途生物技術有限公司
• 主分類號: C12P17/18
• 分類號: C12P17/18;C12R1/465
• 代理公司: 成都華典專利事務所(普通合伙) 51223
• 代理人: 徐豐;楊保剛

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技術領域

????本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領域，具體涉及一種發(fā)酵生產(chǎn)他克莫司的方法。

背景技術

近十多年來，我國器官移植發(fā)展迅速，已躍居亞洲首位，世界第二。用于器官移植后減少排異反應的免疫抑制劑類藥物也呈現(xiàn)快速的增長，普遍用于預防抑制排斥的免疫抑制劑是環(huán)孢菌素，但是其使用常常伴隨著副作用。開發(fā)新型免疫抑制劑變得尤為需要，目前一種新型的免疫抑制劑他克莫司使用正日漸廣泛。

他克莫司(Tacrolimus)?又名FK-506，是由日本藤澤制藥公司于1984?年從土壤放線菌中提取的一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，具有較強的免疫抑制特性。其預防各種器官移植所出現(xiàn)的排斥反應的效果優(yōu)于環(huán)孢菌素。他克莫司能減少肝腎移植受體的急、慢性排斥反應。用本品的患者，細菌和病毒感染率也較環(huán)孢素治療者低，尤其是該藥品有較強的親肝性，對肝移植的功效比環(huán)孢素高100?倍，因而大大降低了臨床使用劑量，可降低原治療費用1/3?～1/2。FK-506?和環(huán)孢菌素合用具有明顯的協(xié)同作用，效果更好。他克莫司不僅可用于防止免疫反應的發(fā)生，還可用于治療已發(fā)生的免疫反應及自身免疫性疾病，對防止器官移植的免疫反應和自身免疫性疾病的治療具有重要意義。

目前有關他克莫司生產(chǎn)方法的報道不多，主要有美國專利US.4,894,366，US.4929611，US5,116,756，US5,264,355，US.5,496,727?和US5,624,842。這些專利報道了用不同的鏈霉菌株生產(chǎn)他克莫司，產(chǎn)量不是很高，US5,116,756?專利中提到的streptomycessp.MA6858?和US5,624,842?中提到的streptomyces?tsukubaensis?的他克莫司生產(chǎn)菌株，生產(chǎn)他克莫司的產(chǎn)量都很低，其發(fā)酵液中他克莫司的濃度最高只有37.8mg/L，導致工業(yè)化生產(chǎn)以后產(chǎn)品的成本很高，給患者造成沉重的負擔。

發(fā)明內(nèi)容

為解決上述問題，本發(fā)明提供一種利用CN1876822公開了的鏈霉菌(Streptomyces?sp1908)CGMCC?No.1288進行發(fā)酵生產(chǎn)他克莫司的方法，采用如下技術方案：

一種發(fā)酵生產(chǎn)他克莫司的方法，包括以下內(nèi)容：

a.?制備鏈霉菌(Streptomyces?sp1908)CGMCC?No.1288的種子液：將保藏的鏈霉菌(Streptomyces?sp1908)CGMCC?No.1288菌株接種在斜面培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)50h，然后接種于液體培養(yǎng)基中，在30℃的搖床中培養(yǎng)50h，即得所述的鏈霉菌種子液；

b.?接種：將步驟a中得到的種子液接種發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為1%；

c.?發(fā)酵培養(yǎng)：將步驟b中得到的接種后的培養(yǎng)基進行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)溫度為28～30℃；

d.?補加哌啶酸：當發(fā)酵培養(yǎng)120h以后，于每升發(fā)酵液中以0.1～1ml//h的流速往發(fā)酵罐中補料流加1.0%的哌啶酸溶液；

e.?發(fā)酵結束并分離：當發(fā)酵培養(yǎng)140～192h以后，結束發(fā)酵，將得到的發(fā)酵液進行提取分離，即得所述的他克莫司。

優(yōu)選地，步驟a中所述的斜面培養(yǎng)基包括以下重量百分比的組份：葡萄糖10%，麥芽粉20%，酵母粉5%，氯化鈉1.5%，瓊脂15%，余量為去離子水。

優(yōu)選地，步驟a中所述的液體培養(yǎng)基包括以下重量百分比的組份：葡萄糖10%，玉米粉20%，酵母粉5%，可溶性淀粉20%，甘油15%，碳酸鈣2%，余量為去離子水。

優(yōu)選地，步驟a中所述的搖床的轉(zhuǎn)速為100~300rpm。

優(yōu)選地，步驟b中所述的發(fā)酵培養(yǎng)基包括以下重量百分比的組份：酵母粉1.5%，可溶性淀粉40%，玉米漿30%，甘油20%，磷酸氫二鉀1.5%，碳酸鈣2%，余量為去離子水。

優(yōu)選地，步驟c中所述的發(fā)酵培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速為150~200rpm。

本發(fā)明具有如下有益效果：

本發(fā)明提供的發(fā)酵生產(chǎn)他克莫司的方法中，對菌種活化的斜面培養(yǎng)基組份、液體培養(yǎng)基組份、種子液接種量、發(fā)酵培養(yǎng)基組份等參數(shù)進行優(yōu)化，維持鏈霉菌的生長活性和發(fā)酵活性，提高他克莫司的生產(chǎn)量；在發(fā)酵過程中，向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加哌啶酸，并對其添加時間和添加量等添加方式進行優(yōu)化，減少了產(chǎn)物的反饋抑制，同時增加了終產(chǎn)物他克莫司的產(chǎn)量，使他克莫司的終產(chǎn)量達到385μg/mL。

具體實施方式