[發(fā)明專利]肋柱花鑒別的引物及PCR方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310642685.5
• 申請日: 2013-12-05
• 公開（公告）號: CN104212883A
• 公開（公告）日: 2014-12-17
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李旻輝;崔占虎;龍平
• 申請（專利權(quán)）人: 李旻輝;崔占虎;龍平
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及蒙藥材及蒙成藥鑒定領(lǐng)域，特別涉及一種能夠特異鑒定肋柱花的PCR擴增方法及其特異引物。?

背景技術(shù)

肋柱花是一種蒙醫(yī)傳統(tǒng)用藥，蒙藥名哈比日跟一地格達。為龍膽科植物肋柱花(Lomatogonium?rotatum(L.)Fries?ex?Nym.)的干燥全草。用于治療瘟疫、傷寒、流感、中暑頭熱等疾病。?

“地格達”來自印度梵語音譯，蒙語為苦的意思。作為蒙醫(yī)常用要藥之一，具有清熱解毒、涼血消腫、平息“協(xié)日”，愈傷之功效。根據(jù)文獻記載和我們的實際調(diào)查研究，內(nèi)蒙古地區(qū)作為“地格達”類蒙藥使用的植物多達7科30余種，然而由于內(nèi)蒙古自治區(qū)區(qū)域廣闊而藥用資源物種分布的區(qū)域性差異明顯，游牧生產(chǎn)過程中徒遷頻繁而就地利用藥用資源等諸多原因，在蒙藥材中，同一品種的名稱、基原、臨床功效與使用等方面因地、因人而異的現(xiàn)象極為普遍。肋柱花作為“地格達”類藥材之一也不例外，同時還調(diào)查統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)含“地格達”類的蒙成藥在內(nèi)蒙古地區(qū)使用也較為廣泛。由于“地格達”類蒙藥基原植物極為復(fù)雜，不同科屬的植物在不同地區(qū)等同入藥，致使目前“地格達”類蒙藥在不同地區(qū)市場流通、醫(yī)療部門及制藥企業(yè)應(yīng)用十分混亂。這些情況同時也反映出了對蒙成藥中使用的“地格達”類生藥進行品種鑒定的必要性和迫切性。因此，建立一種用于鑒別肋柱花的方法非常重要。?

之前鑒別肋柱花的方法，如薄層色譜方法等。胡伊力格其等采用薄層色譜的方法通過分析甲醇、乙醚、石油醚部分對肋柱花進行鑒定(胡伊力格其等.四種地格達類蒙藥材的鑒別研究，內(nèi)蒙古民族大學(xué)學(xué)報，2007，22(3)：328)。本研究組之前使用DNA條形碼技術(shù)對肋柱花進行分子的鑒別研究，但這種方法比較繁瑣，需要測序，不利于推廣。近年來發(fā)展的以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的檢測方法如位點特異性PCR等克服了藥材傳統(tǒng)鑒別方法準(zhǔn)確度不高、主觀性大等缺點。對?肋柱花及其含有其蒙成藥的特異PCR分子鑒別還尚未見報道，本發(fā)明通過特異性PCR的方法實現(xiàn)了肋柱花與含肋柱花的蒙成藥快速、準(zhǔn)確鑒別。在本發(fā)明被公布之前，尚未有任何公開或報道過本專利申請中所提及的PCR方法及引物。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種肋柱花的PCR引物及其鑒定方法，該PCR鑒定方法操作簡單、樣品量少，能快速、準(zhǔn)確的將肋柱花從成藥中鑒定出來，為肋柱花鑒定提供了一種實用的技術(shù)。?

1、一種鑒定肋柱花的特異引物F1、F2，其序列為：?

F1：5’-TTAGTTGTGCCAGAGTTTGC-3’，?

F2：5’-AAGTTCCATCTATAAATGGATAAGA-3’。?

2、一種肋柱花的PCR鑒定方法，其特征在于，包括下列步驟：?

a)從所述材料中提取到DNA樣品；?

b)用權(quán)利要求1所述的引物進行PCR反應(yīng)，擴增反應(yīng)體系包括：10×buffer緩沖液2μL，dNTP1.6μL，引物各0.5μL，EX?Taq酶0.2μL，DNA0.5μL，滅菌蒸餾水14.7μL。反應(yīng)條件：解鏈溫度95℃，時間5min，退火溫度95℃，時間30s，，54℃，時間30s，復(fù)性溫度72℃，時間為1min40s，40個循環(huán)后72℃延伸，時間為7min；?

c)電泳所述擴增產(chǎn)物，如果存在分子量約為232bp的單一條帶，則確定所檢材料為肋柱花。?

附圖說明

圖1：肋柱花及蒙成藥PCR鑒別結(jié)果?

1.空白對照；2.肋柱花(呼倫貝爾盟)；3.地格達-4湯(阿拉善)；4.地格達-8味散(阿拉善)；5.地格達-4味散(錫林郭勒)；M.DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)：從上至下依次為2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp?

具體實施方式

1材料?

所用材料如表1所示，包括：?

表1樣品來源表?

2鑒別引物設(shè)計?

選擇通用引物psbA-trnH(trnH：5’-CGC?GCA?TGG?TGG?ATT?CAC?AAT?CC-3’；psbA：5’-GTT?ATG?CAT?GAA?CGT?AAT?GCT?C-3’)對肋柱花樣品進行擴增，搜索Genbank中蒙成藥地格達4味湯、地格達4味散、地格達8味散中含有的原料藥材的psbA-trnH序列(Genbank登錄號見表2)，然后進行同源比對，根據(jù)其變異區(qū)設(shè)計一對特異引物F1、F2，序列為下：?