[發明專利]一種檢測西馬特羅藥物殘留的酶聯免疫試劑盒及其制備方法與應用

有效

• 申請號: 201310641664.1
• 申請日: 2013-12-03
• 公開（公告）號: CN103630689A
• 公開（公告）日: 2014-03-12
• 發明（設計）人: 李春生;李君華;吳萌;程華;李亞璞;陳英珠;張小兵;董超
• 申請（專利權）人: 河北省科學院生物研究所
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/531;G01N1/28
• 代理公司: 河北東尚律師事務所 13124
• 代理人: 李國聰

1.一種檢測西馬特羅藥物殘留的酶聯免疫試劑盒，其特征在于，它含有：包被有西馬特羅藥物抗原的酶標板、西馬特羅藥物單克隆抗體、酶標記物、西馬特羅標準品溶液、底物顯色液、終止液、濃縮洗滌液、樣本稀釋液。

2.根據權利要求1所述的酶聯免疫試劑盒，其特征在于，所述西馬特羅藥物抗原包括免疫原與檢測原，其為由西馬特羅與載體蛋白采用重氮化法合成的偶聯物，所述載體蛋白為牛血清白蛋白、鼠血清白蛋白、免疫血清蛋白、甲狀腺蛋白、卵清蛋白、血藍蛋白或人血清白蛋白；所述酶標記物為酶標記抗原、酶標記抗體或酶標記抗抗體；所述酶標記物中的標記酶為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酯酶。

3.根據權利要求2所述的酶聯免疫試劑盒，其特征在于，所述西馬特羅藥物免疫原使用牛血清白蛋白為載體；所述西馬特羅藥物檢測原使用卵清蛋白為載體。

4.根據權利要求3所述的酶聯免疫試劑盒，其特征在于，所述西馬特羅藥物單克隆抗體為鼠源、馬源、羊源、兔源或豚鼠源抗體；其由西馬特羅藥物抗原免疫得到。

5.根據權利要求4所述的酶聯免疫試劑盒，其特征在于，所述西馬特羅藥物單克隆抗體為西馬特羅藥物鼠源單克隆抗體。

6.根據權利要求5所述的酶聯免疫試劑盒，其特征在于，所述酶標記抗抗體為酶標記羊抗鼠抗抗體，其采用碘酸鈉法將標記酶與羊抗鼠抗抗體偶聯得到。

7.根據權利要求6所述的酶聯免疫試劑盒，其特征在于，所述西馬特羅標準品溶液的濃度分別為0ug/L、0.1ug/L、0.3ug/L、0.9ug/L、2.7ug/L、8.1ug/L；所述底物顯色液由底物A和底物B組成，底物A為過氧化氫或過氧化脲，底物B為鄰苯二胺或四甲基聯苯胺，底物A和底物B按1：1混混合均勻；所述終止液為1-2mol/L的硫酸溶液；所述濃縮洗液為含有1%吐溫-20的0.2mol/L?PH7.4的磷酸緩沖液；所述樣本稀釋液為含有0.1-5%脫脂奶粉的0.02mol/L?PH7.4的磷酸緩沖液。

8.一種制備權利要求1至7任一權利要求所述的酶聯免疫試劑盒制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

（1）西馬特羅藥物抗原工作液的制備方法包括如下步驟：

（a）CIM重氮化：稱取西馬特羅3.5mg置于10ml螺口瓶中，用1ml0.1mol/L?HCL溶解，冰浴冷卻后，避光，邊攪拌邊逐滴加滅菌雙蒸水至溶解并與已預冷的1mol/L?NaNO₂溶液適量，4℃條件下反應6h，得重氮化CIM溶液備用，其中已預冷的1mol/L?NaNO₂溶液適量為淀粉碘化鉀試紙呈藍黑色；

（b）免疫原的合成：稱取10mg的BSA溶于pH值7.4的1mL0.1mol/L預冷的PBS中，再將步驟(1)所得的重氮化CIM溶液向其中滴加，邊滴加邊攪拌，用1mol/LNaOH溶液調pH值至8.5，4℃條件下反應12h，反應物4℃攪拌下用0.01mol/L?PBS透析3d，每天換液3次，得CIM-BSA溶液；

（c）檢測原的合成：稱取8mg的OVA溶于pH值7.4的1mL0.1mol/L預冷的PBS中，再將步驟（1）所得的重氮化CIM溶液向其中滴加，邊滴加邊攪拌，用1mol/LNaOH調pH值至8.5，4℃條件下反應12h，反應物4℃攪拌下用0.01mol/L?PBS透析3d，每天換液3次，得CIM-OVA溶液；

（2）包被有西馬特羅藥物抗原的酶標板的制備方法包括如下步驟：

（a）用包被緩沖液將西馬特羅藥物抗原工作液稀釋成0.25mg/ml，100ul/孔加入到酶標板孔內；

（b）4℃過夜或37℃孵育2h，傾去孔中液體，洗滌液洗滌4-5次，拍干；

（c）加入含有10%小牛血清的封閉液緩沖液，200ul/孔，37℃孵育2h；

（d）傾去孔中液體，拍干，室溫在真空干燥箱中抽干5h，用鋁箔袋真空塑封，即得包被有西馬特羅藥物抗原的酶標板；

其中，所述包被緩沖液為pH9.6的0.05mol/L的碳酸鹽緩沖液，封閉緩沖液為10%的小牛血清溶液；

（3）西馬特羅藥物單克隆抗體工作液的制備方法包括如下步驟：

（a）動物免疫：選擇載體蛋白為牛血清白蛋白的免疫原，免疫6-8周齡的雌性Blab/c小鼠，間隔2周免疫1次，三次免疫后斷尾取血測定效價和抑制率，選擇結果最佳的小鼠準備融合；

（b）細胞融合：取步驟（1）選定的小鼠的脾細胞和本實驗室保存的SP2/O細胞進行融合，間接ELISA法測定上清液選取陽性高的孔，通過有限稀釋法對陽性孔進行亞克隆，直至建立產生單一抗西馬特羅的單克隆抗體的雜交瘤細胞株；

（c）單克隆抗體的大量制備：選取個體較大的雌性Blab/c小鼠，采用體內誘生腹水法，大量制備腹水，并通過辛酸-硫酸銨沉淀純化腹水，分成小管，-20℃保存；

（4）辣根過氧化物酶-羊抗鼠抗抗體，即酶標記物工作液的制備方法包括如下步驟：

（a）羊抗鼠抗抗體的制備：以羊為免疫動物，以鼠源抗體為免疫原免疫無病原體羊，得到羊抗鼠抗抗體；

（b）酶標記羊抗鼠抗抗體的制備：將辣根過氧化物酶與羊抗鼠抗抗體采用碘酸鈉法進行偶聯；

（5）組建西馬特羅酶聯免疫檢測試劑盒，包括下述各組分：

（a）包被有西馬特羅藥物抗原的酶標板；

（b）西馬特羅藥物單克隆抗體工作液；

（c）酶標記抗抗體：辣根過氧化物酶-羊抗鼠抗抗體；

（d）西馬特羅標準品溶液：采用梯度稀釋法配制西馬特羅標準品溶液，1ml/瓶，濃度分別為0ug/L、0.1ug/L、0.3ug/L、0.9ug/L、2.7ug/L、8.1ug/L；

（e）底物顯色液A液為過氧化脲溶液，底物顯色液B液為四甲基聯苯胺（TMB）溶液；

（f）終止液為1-2mol/L的硫酸溶液；

（g）濃縮洗滌液為含有1%吐溫-20的0.2mol/L?PH7.4的磷酸鹽緩沖液；

（h）樣本稀釋液為含有0.1-5%脫脂奶粉的0.02mol/L?PH7.4的磷酸緩沖液。