[發明專利]抗菌肽Hclocidin18在大腸桿菌中的表達方法

無效

• 申請號: 201310639841.2
• 申請日: 2013-12-04
• 公開（公告）號: CN103667303A
• 公開（公告）日: 2014-03-26
• 發明（設計）人: 相興偉;周宇芳;江玲麗;楊會成;孔寅飛;鄭斌
• 申請（專利權）人: 浙江省海洋開發研究院
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/70;C07K14/435
• 代理公司: 杭州斯可睿專利事務所有限公司 33241
• 代理人: 周豪靖

1.一種Hclocidin18基因，其核苷酸序列如SEQ?ID?No.2所示。

2.一種抗菌肽Hclocidin18在大腸桿菌中的表達方法，其特征在于包括如下步驟：

a、質粒構建：采用大腸桿菌進行重組質粒構建，以家蠶質型多角體病毒BmCPV的多角體蛋白作為融合伴侶；

b、誘導表達；

c、重組質粒編碼的融合蛋白的純化；

d、融合蛋白的裂解和抗菌肽Hclocidin18的收集。

3.根據權利要求2所述的表達方法，其特征在于質粒構建中具體過程如下：

首先，在Hclocidin18基因前加上羥胺裂解位點編碼序列，基因片段5’端加入EcoR?I，3’端加入Xho?I，合成后克隆入pUC18中，構建重組質粒pUC18-?Hclocidin18；

其次，以BmCPV基因組為模板，利用PCR擴增得到多角體蛋白基因，采用的上游引物具有如SEQ?ID?No.3所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ?ID?No.4所示的核苷酸序列，將polh片段克隆入Puc18-?Hclocidin18中Hclocidin18基因的前面，得到重組質粒pUC18-polh-?Hclocidin18，然后將其中的polh-?Hclocidin18融合基因片段克隆入pET30中，得到的重組質粒命名為pET30a-polh-?Hclocidin18。

4.根據權利要求3所述的表達方法，其特征在于：重組質粒pET30a-polh-?Hclocidin18編碼的融合蛋白在N末端帶有His標簽，其表達在IPTG誘導下完成。

5.根據權利要求1所述的表達方法，其特征在于：步驟d具體如下：將融合蛋白溶液與羥氨裂解反應緩沖液混合，55℃孵育24h，?polh-?Hclocidin18融合蛋白成功裂解，然后裂解反應樣品用20mM?pH7.8?PBS透析、離心，獲得含有Hclocidin18的上清，保存并凍干后得到Hclocidin18的粗制品。

6.根據權利要求5所述的表達方法，其特征在于：羥氨裂解反應緩沖液的組分如下：0.22?M?Tris?base,?1.7?M?hydroxylamine-HCl,?4.5?M?gua-nidine-HCl和?1%?1-propanol,?pH?9.0；融合蛋白溶液與羥氨裂解反應緩沖液的體積比為1:3。