[發明專利]基于微懸臂梁平臺的蛋白質模式識別方法

有效

• 申請號: 201310639690.0
• 申請日: 2013-12-04
• 公開（公告）號: CN103675295A
• 公開（公告）日: 2014-03-26
• 發明（設計）人: 王萍;樊春海;金彩虹;何丹農
• 申請（專利權）人: 上海納米技術及應用國家工程研究中心有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 上海東方易知識產權事務所 31121
• 代理人: 唐莉莎

技術領域

本發明是基于微懸臂梁平臺的一種蛋白質識別方法，采用了模式識別技術，利用蛋白質分子與不同化學基團之間的反應造成的微懸臂梁信號的變化，從而達到區分不同種類蛋白質的目的。本發明屬于生物傳感器領域。

背景技術

某些特定蛋白在體內的含量變化往往與某些疾病的發生發展密切相關，因此，一種具有高靈敏度和高準確性的蛋白質識別傳感器將為疾病的早期診斷提供更大的便利。在蛋白質識別中，除了常規的“鎖鑰模型”識別，模式識別在傳感器領域擁有很大的潛力。模式識別的方式最初得益于仿生學，模擬了哺乳動物的嗅覺系統，即當一種氣味與鼻腔中的大量感應細胞相遇時，會產生一組交叉響應信號，根據這組信號的不同來區別不同的氣味。

在傳統的模式識別中，多采用光學或者電化學信號作為傳感陣列的響應信號，而在本發明中，我們設計了一種基于微懸臂梁的傳感陣列，能夠將分子間的相互作用力轉化成微懸臂梁的偏移距離的不同，這種偏移距離以納米計，相當精準。

基于微懸臂梁的模式識別不需要在分子上修飾任何的標記物或外加探針，生物大分子可以不受任何標記物的影響，其自然屬性得以完全保留；并且反應只需一步，可以快速檢出；更重要的是，微懸臂梁有能力被設計成多通道識別的高通量系統，能夠在一小時內識別出上千種蛋白分子。

截止目前為止，對于微懸臂梁的研究都停留在儀器本身的性能階段，而對其的應用則遠沒有達到用于識別多種蛋白質，只有簡單的單一物質檢測，且應用并不廣泛，有很大局限性，檢測物質多受限于已知的特異反應。本發明開創了一種全新的方法，將力學信號響應應用于多種蛋白分子的識別，并不局限于已知的特異反應。它的特點就在于通過一組非特異反應信號，來區分不同的物質，尤其在疾病早期診斷中有著巨大的應用潛力。

發明內容

本發明針對傳統蛋白質識別方法--抗原抗體識別法的不足，可適用于多種蛋白，尤其是無抗原抗體特異反應，或者抗體獲得困難的蛋白分子的識別。

一種基于微懸臂梁的蛋白質模式識別方法，其特征在于：

基于微懸臂梁技術，將含有不同化學基團的化合物修飾于懸臂梁表面作為傳感陣列，待測蛋白與該陣列接觸反應，不同蛋白與該傳感陣列間的分子相互作用力不同，從而造成微懸臂梁偏移中心的距離不同，通過測量這種距離，獲得一組指紋數據，可區分不同蛋白；還利用了線性判別分析法分析多組指紋數據，證明了該方法可區分不同的蛋白質，具體步驟如下：

（1）傳感陣列的制備

選用單面鍍金的微懸臂梁探針，利用金與巰基之間的化學鍵，將6種帶有不同化學基團的巰基化合物固定于微懸臂梁探針的鍍金表面；這6種物質分別為：（3-巰基丙基）三甲氧基硅烷，11-巰基-1-十一醇，芐硫醇，1-十二硫醇，11-巰基十一烷酸，2-二甲氨基乙硫醇鹽酸鹽；當然也可以采用更多帶有其他基團的化合物；

先將微懸臂梁探針置于無水乙醇中3分鐘，后用紫外線照射5分鐘滅菌；將此探針固定于修飾樣品臺上，每個梁分別浸入毛細管的一端，毛細管的另一端浸入待修飾溶液，利用毛細管的虹吸效應，使得不同的懸臂梁修飾上不同的巰基化合物；巰基化合物溶解于乙醇溶液中，濃度為100nM，修飾在室溫進行，時間為30分鐘；

（2）蛋白檢測

將修飾好的傳感陣列，微懸臂梁探針，置于檢測池中，控制檢測溫度為25℃；先向檢測池中沖入TE緩沖溶液（Tris-HCl?10mM,?EDTA?1mM,?NaCl?1M,?pH7.4），靜待微懸臂梁信號平穩，即空白曲線平穩后，加入0.1mg/ml的待測蛋白溶液，溶劑同為TE緩沖液；這時，所有的微梁都會由于結合了蛋白而向上或向下彎曲，根據蛋白與傳感陣列上修飾化合物之間結合力的不同，微梁最終會達到不同的平衡值；

我們分別檢測了6種不同的蛋白，數均分子量從11.7KDa到340KDa，等電點從4.47-7.8；微梁在5分鐘以內達到穩定信號值；

本發明所采用的蛋白分別為：白蛋白Mw=68KDa,?pI=4.7-4.9，細胞色素CMw=38KDa,?pI=4.47-4.57，纖維蛋白原Mw=340KDa,?pI=4.8，免疫球蛋白?GMw=150KDa,?pI=7.4，脂蛋白Mw=38KDa,?pI=4.9，枯草桿菌蛋白酶?BMw=27.6KDa,?pI=7.8。

優選地，所述微懸臂梁的探針為鍍金，或其他類型探針。

優選地，所述修飾于微梁上的化合物還可為DNA，或無機分子，或有機分子；其用于固定不同化合物的方法還可為抗原抗體反應，或DNA配對。