[發(fā)明專利]一種降低茶樹組織培養(yǎng)過程中外植體污染的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310639348.0
• 申請日: 2013-12-04
• 公開（公告）號: CN103609454A
• 公開（公告）日: 2014-03-05
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 孫威江;吳婉婉
• 申請（專利權(quán)）人: 福建農(nóng)林大學(xué)
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 福州元創(chuàng)專利商標(biāo)代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學(xué)俊

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于茶樹組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種降低茶樹組織培養(yǎng)過程中外植體污染的方法。

背景技術(shù)

茶樹（Camellia?sinensis?L.?Kuntze.）屬山茶科，山茶屬，是一種多年生的木本、常綠植物。茶樹組織培養(yǎng)開始于上個世紀(jì)60年代。目前，茶樹組織培養(yǎng)已經(jīng)通過對茶樹的種子、莖段、腋芽、花藥等進(jìn)行培養(yǎng)獲得了完整的再生植株。茶樹是自身攜帶內(nèi)生菌較多的一種植物，因此，在進(jìn)行組織培養(yǎng)過程中外植體污染嚴(yán)重，嚴(yán)重制約著茶樹組織培養(yǎng)的發(fā)展。因此，研究一種降低茶樹組織培養(yǎng)過程中外植體污染的方法成為本領(lǐng)域目前迫切需要解決的技術(shù)難題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種降低茶樹組織培養(yǎng)過程中外植體污染的方法，該方法能夠降低茶樹組織培養(yǎng)過程中外植體發(fā)生的污染，提高成活率。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種降低茶樹組織培養(yǎng)過程中外植體污染的方法，其特征在于：具體步驟如下：

（1）取春季生長健壯的、帶飽滿腋芽的茶樹莖段為外植體；

（2）將外植體剪成小段，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為75%的酒精消毒20-25s，無菌水沖洗2遍；用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的升汞消毒4min，無菌水沖洗2遍?；再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的升汞消毒5min，無菌水沖洗3-5遍；

（3）將外植體切口處因消毒變色的部分切下，然后切成1-1.5cm長，帶一個腋芽的莖段；

（4）將上述莖段接在含有抗生素的培養(yǎng)基上，每個瓶子接種1-2個莖段，接種后放入培養(yǎng)室中進(jìn)行培養(yǎng)。

所述培養(yǎng)基為：MS+1.5?mg/L?6-BA?+0.3mg/L?NAA+蔗糖30g+瓊脂粉6.5g，pH值調(diào)至5.6-5.8，配制好的培養(yǎng)基分裝在500mL的廣口三角瓶中，高溫滅菌20min。

培養(yǎng)基中加入抗生素的組成成分及濃度如下：

氨芐青霉素：200mg/L；

硫酸鏈霉素：150mg/L。

所述含抗生素的培養(yǎng)基是將抗生素經(jīng)微孔過濾器抽濾滅菌后，加入到裝有培養(yǎng)基的廣口三角瓶中，搖勻后再分裝到培養(yǎng)瓶中。

培養(yǎng)條件為：溫度23-25?℃，光照強(qiáng)度1500-2000lx，光照時間12h/d，培養(yǎng)30d-35d。

本發(fā)明的顯著優(yōu)點在于：

（1）本發(fā)明能有效降低茶樹組織培養(yǎng)過程中外植體的污染，提高組織培養(yǎng)的成功率。

（2）本發(fā)明通過在培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素和硫酸鏈霉素，能達(dá)到較好的抑菌效果，使外植體的污染率降低35%-37?%，萌芽率達(dá)42%-44%。

具體實施方式

實施例1

一種降低茶樹組織培養(yǎng)過程中外植體污染的方法，其具體步驟如下：

（1）取春季生長健壯的、帶飽滿腋芽的茶樹莖段為外植體；

（2）將外植體剪成小段，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為75%的酒精消毒20s，無菌水沖洗2遍，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的升汞消毒4min，無菌水沖洗2遍，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的升汞消毒5min，無菌水沖洗5遍；

（3）將外植體傷口處因消毒變色的部分切下，然后切成1-1.5cm長，帶一個腋芽的莖段，待用；

（4）以MS+1.5?mg/L?6-BA?+0.3mg/L?NAA+蔗糖30g+瓊脂粉6.5g配制培養(yǎng)基，將pH值調(diào)至5.6，配制好的培養(yǎng)基分裝在500mL的廣口三角瓶中，高溫滅菌20min；

（5）將氨芐青霉素和硫酸鏈霉素經(jīng)微孔過濾器抽濾滅菌，按每升培養(yǎng)基加入200mg氨芐青霉素和150mg硫酸鏈霉素的比例，分別將氨芐青霉素和硫酸鏈霉素加入到裝有培養(yǎng)基的廣口三角瓶中，搖勻后再分裝到培養(yǎng)瓶中；

（6）將處理后的莖段接在含有抗生素的培養(yǎng)基上，每個瓶子接種2個莖段，共接種30個，接種后放入培養(yǎng)室中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：溫度23?℃，光照強(qiáng)度1500lx，光照時間12h/d，培養(yǎng)30d后，污染率35.91%，萌芽率42.63%。

實施例2

一種降低茶樹組織培養(yǎng)過程中外植體污染的方法，其具體步驟如下：

（1）取春季生長健壯的、帶飽滿腋芽的茶樹莖段為外植體；

（2）將外植體剪成小段，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為75%的酒精消毒23s，無菌水沖洗2遍，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的升汞消毒4min，無菌水沖洗2遍，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的升汞消毒5min，無菌水沖洗4遍；