[發明專利]一種從纖維堆囊菌發酵液中分離提取埃博霉素B的方法

有效

• 申請號: 201310637264.3
• 申請日: 2013-11-27
• 公開（公告）號: CN103667387A
• 公開（公告）日: 2014-03-26
• 發明（設計）人: 龔國利;趙婷峰;李慧
• 申請（專利權）人: 陜西科技大學
• 主分類號: C12P17/18
• 分類號: C12P17/18;C07D493/04;C12R1/01
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責任公司 61200
• 代理人: 蔡和平

1.一種從纖維堆囊菌發酵液中分離提取埃博霉素B的方法，其特征在于，包括以下步驟：

1）將纖維堆囊菌菌株搖瓶培養72-96h，將得到的搖瓶菌種液接種至一級種子罐中一級放大培養72-96h，將得到的一級菌種液接種至二級種子罐中二級放大培養72-96h，將得到的二級菌種液轉入發酵罐中三級放大發酵培養12-96h后，得到發酵液；

2）向發酵液中加入發酵液總體積1%～5%的大孔吸附樹脂，調節pH值至7.0～7.4后，繼續培養100-150h后，停止發酵；

3）收集步驟2）發酵結束后的液體中的大孔吸附樹脂，用大孔吸附樹脂3～5倍體積的乙酸乙酯進行洗脫，收集乙酸乙酯洗脫液，濃縮，得到含有埃博霉素B的粗提物；

4）將含有埃博霉素B的粗提物用甲醇溶解后，離心，將上清液經葡聚糖凝膠柱層析進行分離，用HPLC進行檢測，合并含有埃博霉素B的組分，得到埃博霉素B分離液；

5）向埃博霉素B分離液中加入該分離液總體積2%～5%的分子印跡聚合物，搖床處理18～30h后，用甲醇進行洗脫，收集甲醇洗脫液；

6）將甲醇洗脫液濃縮后，得到濃縮液，將濃縮液低溫結晶處理，析出的白色結晶即為埃博霉素B。

2.根據權利要求1所述的一種從纖維堆囊菌發酵液中分離提取埃博霉素B的方法，其特征在于，步驟1）所述的搖瓶、一級種子罐和二級種子罐中所用的培養基均為M26液體培養基，成分為：土豆淀粉7.5～8.0g/L，大豆蛋白胨1.5～2.0g/L，葡萄糖1.5～2.0g/L，酵母粉1.5～2.0g/L，MgSO₄·7H₂O1.0～1.2g/L，CaCl₂1.0～1.2g/L，EDTA-Fe³⁺1mL/L，微量元素1mL/L，pH值為7.2；

所述的發酵罐中的培養基成分為：土豆淀粉2.5～3.0g/L，蔗糖0.7～1.0g/L，葡萄糖0.2～0.5g/L，豆餅粉1.7～2.0g/L，MgSO₄·7H₂O2.3～2.5g/L，CaCl₂3.0～3.5g/L，EDTA-Fe³⁺2mL/L，微量元素0.5～1.0mL/L，pH值為7.2。

3.根據權利要求1所述的一種從纖維堆囊菌發酵液中分離提取埃博霉素B的方法，其特征在于，步驟1）所述的搖瓶中的培養溫度為30℃，轉速為180～220rpm；所述的一級種子罐、二級種子罐及發酵罐中的培養溫度為30℃，轉速為150～200rpm，空氣流量比為1:0.5，罐壓為0.04～0.1kg/cm²；步驟2）加入大孔吸附樹脂后，轉速調整至120～150rpm。

4.根據權利要求1所述的一種從纖維堆囊菌發酵液中分離提取埃博霉素B的方法，其特征在于，步驟2）所述的大孔吸附樹脂為XAD-16型大孔吸附樹脂。

5.根據權利要求4所述的一種從纖維堆囊菌發酵液中分離提取埃博霉素B的方法，其特征在于，步驟2）所述的大孔吸附樹脂在使用前經過預處理，包括：先用3～5倍柱體積的甲醇浸泡大孔吸附樹脂，搖床震蕩12～24h后，去除甲醇，水洗至無醇味，再用甲醇浸泡12～24h后，水洗至無醇味，備用。

6.根據權利要求1所述的一種從纖維堆囊菌發酵液中分離提取埃博霉素B的方法，其特征在于，步驟3）所述的洗脫時間為18～32h，所述的濃縮是將乙酸乙酯洗脫液在40～45℃下，真空度為-0.09～-0.085MPa的條件下，真空濃縮至干。

7.根據權利要求1所述的一種從纖維堆囊菌發酵液中分離提取埃博霉素B的方法，其特征在于，步驟4）所述的葡聚糖凝膠柱層析選用Sephadex?LH-20層析柱，流動相選用甲醇，上樣量為柱體積的1%～2%，流動相流速為8～12mL/min，展開距離為7.2～7.8cm/h。

8.根據權利要求1所述的一種從纖維堆囊菌發酵液中分離提取埃博霉素B的方法，其特征在于，步驟4）所述的離心是在15～25℃下，5000～10000rpm，離心10～20min。

9.根據權利要求1所述的一種從纖維堆囊菌發酵液中分離提取埃博霉素B的方法，其特征在于，步驟5）所述的分子印跡聚合物是埃博霉素B分子印跡聚合物。

10.根據權利要求1所述的一種從纖維堆囊菌發酵液中分離提取埃博霉素B的方法，其特征在于，步驟6）所述的濃縮是將甲醇洗脫液在40～45℃下，真空度為-0.09～-0.085MPa的條件下，真空濃縮至甲醇洗脫液體積的1/10；所述的低溫結晶處理是將濃縮液在-20～-15℃下低溫處理至析出白色結晶。