[發明專利]枯草芽孢桿菌Pc3及其在制備防治植物致病真菌發酵上清液中的應用

有效

• 申請號: 201310637219.8
• 申請日: 2013-12-02
• 公開（公告）號: CN103589674A
• 公開（公告）日: 2014-02-19
• 發明（設計）人: 陳新華;郭文斌;崔鵬飛
• 申請（專利權）人: 國家海洋局第三海洋研究所
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;A01N63/00;A01P3/00;C12R1/125
• 代理公司: 廈門南強之路專利事務所(普通合伙) 35200
• 代理人: 馬應森

技術領域

本發明涉及芽孢桿菌，尤其是涉及一種枯草芽孢桿菌Pc3及其在制備防治植物致病真菌發酵上清液中的應用。

背景技術

隨著植物病蟲害對已有農藥的耐藥性及新病害的出現，要求不斷開發新的農藥。微生物資源一直是農業工作者研究的重點資源，尋找新的微生物源先導化合物或活性產物是農藥創制的主要手段之一。但是由于研究開發時間長，對篩選技術要求較高，篩選得到新型農用活性物質越來越困難。從新藥研發的進程來看，絕大部分還是來自于自然資源(Bevan?et?al.1995)，其中包括微生物和植物提取物的活性篩選(Shadomy.1987)。

隨著陸地微生物資源的日漸枯竭，從陸源微生物中發現新結構活性物質的幾率越來越小。新的微生物類群在微生物代謝產物研究領域越來越受到人們的重視，而且也是篩選新的微生物代謝產物的一條重要途徑。近年對海洋和極地微生物資源的研究結果充分證明，利用海洋和極地微生物資源研制開發新型藥物具有著巨大的潛力和誘人的前景(Zhang?et?al.2005)。

南極由于其獨有的地理及氣候特征，是一個潛在的、有待開發的微生物資源庫。它不僅是獨特生態系統微生物的生存繁衍地，而且是新型生物活性物質（如酶、多糖及脂類等)和先導化合物合成菌株的潛在種源地。在這種特殊的生態多樣性環境中生存的微生物，可能具有不同于陸生微生物的獨特的遺傳和代謝多樣性。因此，南極微生物資源可能是新型化合物或新型活性代謝產物的潛在來源。

芽孢桿菌是一類好氧、能產芽孢的革蘭氏陽性桿狀細菌。這類菌能產生脂肽抗生素、細胞壁降解酶類、細菌素、抗菌蛋白及揮發性抗菌物質，對某些植物病原真菌或細菌、甚至某些動物病原菌、病毒等表現出一定的抑制作用（(Stein2005）。同時，這類細菌可以通過發酵大規模獲得，且產生的芽孢對高溫、強酸、紫外線具有很強的耐受力。因此，有關芽孢桿菌的研究已成為近幾年國內外的研究熱點之一。已報道的能抑制真菌生長的芽孢桿菌主要包括枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、蘇云金芽孢桿菌(B.thuriniensis)、蠟狀芽孢桿菌(B.cereus)、短小芽孢桿菌(B.pumilus)、多粘芽孢桿菌(B.polymyxa)、解淀粉芽孢桿菌(B.amyloloquefaci)等。

發明內容

本發明的目的之一在于提供一株枯草芽孢桿菌（Bacillus?subtilis）Pc3。

本發明的目的之二在于提供一種枯草芽孢桿菌（Bacillus?subtilis）Pc3在制備防治植物致病真菌發酵上清液中的應用。

所述枯草芽孢桿菌（Bacillus?subtilis）Pc3分離自中國第28次南極科學考查所采集的海水樣品（D3-3站點；W50.76°，N61.16°）；該菌已于2013年10月13日保藏于中國典型培養物保藏中心，中國典型培養物保藏中心的地址為中國，武漢，武漢大學，郵編為430072，保藏中心保藏編號為CCTCC?NO：M2013470。

所述枯草芽孢桿菌（Bacillus?subtilis）Pc3分離自中國第28次南極科學考查所采集的海水樣品，通過聚合酶鏈式反應(PCR)擴增其16S?rDNA序列，與美國國家生物技術信息中心(NCBI)GenBank數據庫中相應的序列進行比對分析，發現其與芽孢桿菌屬(Bacillus?sp.)具有99%的序列相似性；16S?rDNA序列的GenBank登錄號為KF751703。

為實現植物致病真菌防治的目的，首先將該菌在含有5ml?LB培養基的試管中進行活化培養，然后將活化的菌株接種到1L發酵培養基中進行培養，發酵結束后離心除去菌體，得到發酵上清液，該發酵上清液直接噴灑植物用于致病真菌的防治。

所述LB培養基的組成如下（g/L）：葡萄糖20，KH₂PO₄6，K₂HPO₄14，MgSO₄0.2，(NH4)₂SO₄4，2ml微量元素（FeSO₄·4H₂O，CaCl₂·2H₂O，MnSO₄·4H₂O，ZnCl₂各1mM，過濾除菌后放入無菌試劑瓶中備用），0.1MPa滅菌30min。

所述離心除去菌體是指在6000～8000g下離心10min。