[發(fā)明專利]一種脫細胞肌腱材料的制備方法及其用途

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310636964.0
• 申請日: 2013-12-02
• 公開（公告）號: CN104208750A
• 公開（公告）日: 2014-12-17
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 秦廷武;江燕林;寧良菊
• 申請（專利權(quán)）人: 四川大學(xué)華西醫(yī)院
• 主分類號: A61L27/36
• 分類號: A61L27/36
• 代理公司: 成都高遠知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 51222
• 代理人: 李高峽;張娟

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種脫細胞肌腱材料的制備方法及其用途，屬于生物材料領(lǐng)域。?

背景技術(shù)

肌腱是一種血供少、細胞比重少的致密結(jié)締組織，主要由高度沿軸向排列的膠原纖維組成，因而在承受載荷時可提供最大的抗應(yīng)變能力，是一種良好的肌腱/韌帶損傷或缺損的修復(fù)支架。但是異體或異種來源的肌腱組織，因其細胞上具有多種免疫原性物質(zhì)，如細胞核內(nèi)的DNA會引起所有動物發(fā)生免疫排斥反應(yīng)，細胞膜上的α-半乳糖基抗原（α-gal）會引起靈長類動物發(fā)生免疫排斥反應(yīng)，用于體內(nèi)修復(fù)的效果不盡人意，同時存在安全隱患。因此，在制備用于體內(nèi)修復(fù)的肌腱時，通常采用各種脫細胞方法，去除肌腱組織細胞中的核物質(zhì)，若用于靈長類動物修復(fù)時，應(yīng)同時去除肌腱組織細胞膜上的α-gal。?

肌腱脫細胞處理可以采用常用的去垢劑，如Triton?X-100、SDS、Trypsin，其可以有效去除免疫原性物質(zhì)，降低肌腱的免疫原性，但同時也會破壞肌腱的超微結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致力學(xué)性能顯著下降，生物活性因子也顯著減少，制得的肌腱具有去垢劑殘留。?

采用超聲、反復(fù)凍融、核酸酶和/或α-半乳糖苷酶進行脫細胞處理，不會破壞肌腱的結(jié)構(gòu)，但是難以有效去掉肌腱的免疫原性物質(zhì)。如，江燕林等采用反復(fù)凍融與核酸酶處理聯(lián)用的方式制備脫細胞肌腱，具體是取小牛跟腱，采用液氮冷凍/37℃復(fù)溫反復(fù)凍融5次，再在含有150U/ml?DNase和100μg/ml?RNase的核酸酶溶液中處理24h，HE染色和DAPI染色顯示肌腱內(nèi)膜上仍有部分細胞核殘留，DNA殘留量檢測結(jié)果顯示DNA殘留量高達（0.05±0.02）μg/mg，免疫原性較高（江燕林等，“脫細胞小牛肌腱組織形態(tài)學(xué)和生物力學(xué)特性研究”，中國修復(fù)重建外科雜志,2013,27(5):71-76）。另外，江燕林等還研究發(fā)現(xiàn)，在反復(fù)凍融、核酸酶處理小牛跟腱的基礎(chǔ)上，再用α-半乳糖苷酶處理24h，α-半乳糖基抗原（α-gal）的含量顯著下降，但DNA殘留量并無明顯變化，免疫原性仍然較高（江燕林等，“異種脫細胞肌腱生物支架的生物力學(xué)特性研究”，醫(yī)用生物力學(xué)，2012,27(10):370）。?

因此，如何在有效脫細胞、去異種抗原的同時，保留肌腱組織的結(jié)構(gòu)形態(tài)、生物力學(xué)特性和生物活性因子是目前研究脫細胞肌腱材料面臨的難題。?

發(fā)明內(nèi)容

為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種新的制備脫細胞肌腱材料的方法，以及該方法制備的脫細胞肌腱材料及其用途。?

本發(fā)明脫細胞肌腱材料的制備方法，包括如下步驟：?

（1）取新鮮肌腱，清洗；?

（2）將肌腱沿厚度方向進行壓縮，壓縮率為60～90%；?

（3）對步驟（2）壓縮后的肌腱進行反復(fù)凍融；?

（4）將步驟（3）處理后的肌腱用核酸酶處理，清洗，即可。?

優(yōu)選地，步驟（2）中，所述壓縮率為70～80%。?

步驟（3）中，所述反復(fù)凍融是將步驟（2）壓縮后的肌腱置于液氮中1～3min，25～37℃放置3～10min，重復(fù)操作4～6次。優(yōu)選地，所述反復(fù)凍融是將步驟（2）壓縮后的肌腱置于液氮中1min，37℃放置5min，重復(fù)操作5次。?

步驟（4）中，核酸酶處理的方法為：取步驟（3）處理后的肌腱，置于DNase濃度為120～180IU/ml、RNase濃度為80～120μg/ml的核酸酶溶液中，室溫或37℃恒溫處理6～24h。優(yōu)選地，所述核酸酶溶液中，DNase的濃度為150IU/ml，RNase的濃度為100μg/ml；所述處理的溫度為37℃，處理的時間為6h。?

DNase：脫氧核糖核酸酶；RNase：核糖核酸酶。?

因α-gal（α-半乳糖基抗原）會引起靈長類動物的免疫排斥反應(yīng)，在制備用于修復(fù)靈長類動物的脫細胞肌腱時，需要在前述處理方法基礎(chǔ)上，進一步采用α-半乳糖苷酶去除α-gal，即將前述步驟（4）處理后的肌腱，置于α-半乳糖苷酶濃度為3～8U/ml的溶液中，15～40℃處理6～24h。優(yōu)選地，所述溶液中，α-半乳糖苷酶的濃度為5U/ml；所述處理的溫度為26℃，所述處理的時間為6h。?

本發(fā)明還提供了前述任意一項方法制備的脫細胞肌腱材料，以及該材料在制備治療軟組織缺損修復(fù)材料中的用途，優(yōu)選地，所述軟組織缺損修復(fù)材料是肌腱組織或韌帶組織缺損修復(fù)材料。?