[發明專利]二化螟內源小RNA在水稻抗蟲改良中的應用

在審

• 申請號: 201310636332.4
• 申請日: 2013-12-02
• 公開（公告）號: CN104673827A
• 公開（公告）日: 2015-06-03
• 發明（設計）人: 陳浩;江山;張志偉;林擁軍
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;C12N15/113;A01H5/00
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 張紅兵

技術領域

本發明屬于植物基因工程技術領域。具體涉及二化螟內源小RNA在水稻抗蟲改良中的應用。克隆得到一條二化螟[Chilo?suppressalis（Walker）]內源小RNA序列，對該序列的功能驗證和在水稻抗蟲改良中的應用研究。?

背景技術

水稻是世界上主要糧食作物之一，約有一半的世界人口以其為主食。在農業生產上，病蟲害會導致水稻生產的大規模減產，造成巨大的經濟損失。二化螟是水稻的主要害蟲之一，廣泛分布于亞洲、大洋洲、北非、南歐等國家；在我國除青海和西藏外，各省均有二化螟的發生（盛承發等2003)。近年來，二化螟的危害在我國多數稻區呈上升趨勢（陳豪等2010）。在水稻生產上，化學試劑是二化螟防治的主要手段，但人們也在積極探索其他更經濟和低環境危害的方法。Bt基因在水稻上的應用對于鱗翅目的二化螟有較好的防治，但其他新的方法也在不斷被嘗試以備二化螟在Bt水稻篩選壓下產生抗性。?

RNA干涉現象（RNA?interference,RNAi）最早在牽牛花中被發現（Napoli?et?al.1990），并由Fire等人明確將其名為RNAi（Fire?et?al.1998）。RNAi的機制被發現后，廣被泛運用在基因治療、功能基因組研究和品種改良中。近年來，人們嘗試用RNAi技術在植物抗蟲育種方面進行應用，Mao等人用表達dsRNA的轉基因擬南芥和煙草喂飼棉鈴蟲，發現其植株對棉鈴蟲具有抗性（Mao?et?al.2007）；Baum等人用人工合成的dsRNA喂飼西部玉米根蟲（western?corn?rootworm），12h到1d后，害蟲的目標基因表達顯著下降（Baum?et?al.2007）。?

MiRNA是一類長約21～28nt的非編碼（non-coding）RNA（Lagos-Quintana?et?al.2001;Lau?et?al.2001;Lee?and?Ambros2001;Couzin2002)，來源于60～80nt的發夾前體pre-miRNA。一般pre-miRNA的長度在動物中比較恒定，但在植物中其長度的變化性較大，可以從幾十到幾百nt（Reinhart?et?al.2002;LAGOS-QUINTANA?et?al.2003)。miRNA的主要功能是在生物體生長和發育過程中起著基因表達調控的作用，如在線蟲的miRNA?lin-4通過與靶標mRNA的3’末端的非翻譯區不完全配對來對靶標mRNA進行翻譯后抑制，lin-4的突變往往造成線蟲發育形態的改變（Banerjee?and?Slack2002;Pasquinelli?and?Ruvkun2002）新miRNA的發現可通過直接克隆或生物信息學分析得到。其中直接克隆的方法耗時耗力，人們更傾向于通過生物信息學的方法來發現新miRNA。生物信息學的方法需要依靠高通量測序技術，它能一次對幾十萬?到幾百萬條的DNA分子進行序列測定。采用邊合成邊測序（sequencing?by?synthesis）的策略可減少因二級結構造成的區域缺失，并具有所需樣品量少，高通量，高精確性，擁有簡單易操作的自動化平臺和功能強大等特點。目前，不少物種已經通過高通量測序的方法發現了很多新的miRNA并上傳至miRNA數據庫miRBase（Kozomara?and?Griffiths-Jones2011），如通過小RNA高通量測序，在蝗蟲中發現55個miRNA序列（Wen?et?al.2009），在松材線蟲中確定出37個新miRNA（Huang?et?al.2010），在家豬中的10個樣本中發現了777條新的miRNA（Li?et?al.2010）等。?