[發明專利]一種芍藥成熟種胚的石蠟切片制作方法

有效

• 申請號: 201310636143.7
• 申請日: 2013-12-03
• 公開（公告）號: CN103630421A
• 公開（公告）日: 2014-03-12
• 發明（設計）人: 孫曉梅;劉廣林;陸秀君;張麗杰;楊盼盼;邢司藝;楊宏光;王亞斌
• 申請（專利權）人: 沈陽農業大學
• 主分類號: G01N1/06
• 分類號: G01N1/06;G01N1/28
• 代理公司: 沈陽科威專利代理有限責任公司 21101
• 代理人: 張述學

技術領域

本發明涉及一種石蠟切片的制作方法，尤其涉及一種芍藥成熟種胚的石蠟切片制作方法。

背景技術

芍藥（Paeonia?lactiflora）為芍藥科芍藥屬多年生宿根花卉，是中國的傳統名花，栽培歷史悠久，與牡丹并稱“花中二絕”，是植物造景和切花的優良材料，觀賞價值極高。

在長期的系統演化過程中，芍藥種子形成了特殊的休眠萌發特性，即上、下胚軸休眠特性。種子繁殖是獲得芍藥實生苗的唯一手段，是無性繁殖的基礎。自然條件下從播種到出苗需要6～7個月的時間，生長周期長，對芍藥的人工栽培生產和種子檢驗帶來很大的困難。探討這種特殊的雙重休眠機理機制，在學術上和解決生產實踐中遇到的問題均具有重要意義。胚是種子萌發的主體，而對芍藥種子胚萌發的研究少見報道。

石蠟切片是組織學研究中的重要實驗技術，其基本步驟包括樣品的取材、固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、粘片、脫蠟、染色和封片等一系列特殊處理。整個過程雖然并不復雜，但要制出高質量的切片，每一個步驟的操作都很重要，且具有不同組織結構的植物以及植物不同部位的組織結構所需的處理不同，需要進行摸索和改進。而芍藥成熟種胚石蠟切片技術方面的相關研究報道很少。

綜上所述，如果能找到芍藥成熟種胚石蠟切片的制備方法，能為研究芍藥種子休眠和萌發提供準確的技術支持，對揭示芍藥種子休眠機理具有重要意義。

發明內容

本發明的目的在于針對芍藥種子胚乳多、浸蠟難和種胚小、難操作的問題，找到一種操作簡單方便的芍藥成熟種胚石蠟切片的制備方法，使制作的切片組織結構完整、清晰，易于觀察。

本發明的技術方案如下：

1、取材和固定：

（1）洗種子：用洗潔精清洗10～20min，流水沖洗干凈。

（2）種子的篩選：水選，浸種2～3h之后，去除上浮的不充實種子。

（3）用濃度0.5%的高錳酸鉀溶液對芍藥種子進行40min消毒處理，用蒸餾水沖洗干凈。

（4）在恒溫箱中，45℃溫水浸種48h，使種皮軟化，種子吸水。

（5）去除上浮的不充實種子。

（6）用吸水紙吸干種子表面的水分，用手術刀剝去種皮，將芍藥種子切割成含有胚的種尖部分（四周含部分胚乳）迅速放入盛FAA固定液（福爾馬林、冰醋酸和濃度70%乙醇的體積比為1：1：18）的青霉素藥瓶中固定，4℃冰箱放置，固定24h以上。

2、脫水：將固定好的材料放入濃度70%的乙醇中泡洗3～5次，先后轉入濃度70%乙醇、濃度80%乙醇、濃度90%乙醇、濃度95%乙醇進行梯度脫水，各梯度間隔時間為1.5h。之后無水乙醇浸泡1h，然后更換無水乙醇再浸泡1h，對材料徹底脫水。

3、透明：脫水后的芍藥成熟種胚依次放入體積比為2:1的無水乙醇和二甲苯混合液、體積比為1:1的無水乙醇和二甲苯混合液、體積比為1:2的無水乙醇和二甲苯混合液浸泡，各級浸泡透明2h，然后更換純二甲苯浸泡1h，再次更換純二甲苯浸泡30min。

4、浸蠟和包埋：透明處理后將青霉素瓶中的二甲苯倒出1/2，向瓶中添加蠟屑（熔點為52～54℃和62～64℃的混合蠟屑，兩者體積比1:1）直到飽和，放回恒溫箱中，40℃過夜，青霉素瓶蓋兒漏縫蓋，讓二甲苯慢慢蒸發。第二天早上，再向小瓶中加1/5藥瓶體積的蠟屑，敞口放置于60℃恒溫箱中，2h后把原溶液傾去，換熔融石蠟（熔點為52～54℃和62～64℃的混合蠟屑，兩者體積比1:1），之后每2h換一次蠟液，每天3次，重復5天后進行常規石蠟包埋。

5、切片：根據材料在蠟塊中的位置和方向，將蠟塊修成梯形，然后粘到切片機的蠟臺上進行切片，采用旋轉式手動切片機，切片厚度7～10μm。

6、展片及粘片：粘片劑采用明膠粘片劑（1g明膠溶于100ml蒸餾水中）。在潔凈的載玻片上均勻涂上少許明膠，將蠟帶光面小心地放在載玻片上，以水作漂浮劑，在50℃恒溫水浴鍋的鐵板上使蠟帶展平，之后自然干燥。