[發(fā)明專利]聚丙烯酰胺凝膠框定區(qū)域快速染色方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310634022.9
• 申請(qǐng)日: 2013-11-28
• 公開（公告）號(hào): CN103604680A
• 公開（公告）日: 2014-02-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 勞方業(yè);齊永文;鄧海華
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣州甘蔗糖業(yè)研究所
• 主分類號(hào): G01N1/30
• 分類號(hào): G01N1/30
• 代理公司: 廣州嘉權(quán)專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 44205
• 代理人: 鄭瑩

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種聚丙烯酰胺凝膠染色的方法，具體涉及一種聚丙烯酰胺凝膠框定區(qū)域快速染色的方法。

背景技術(shù)

聚丙烯酰胺凝膠電泳(Polyacrylamide?gel?electrophoresis，PAGE)自1959年建立以來(lái)，已成為分析蛋白質(zhì)和核酸樣品的一種常用方法，?在分子生物學(xué)及相關(guān)學(xué)科的基礎(chǔ)和臨床研究中被廣泛應(yīng)用。由于其具有較高的分辨率，?尤其在AFLP、SSR、SNP?等分子標(biāo)記研究和遺傳圖譜構(gòu)建等方面應(yīng)用更多。

電泳后對(duì)樣品的顯示有許多方法，?目標(biāo)產(chǎn)物的檢測(cè)主要采取顯色法，?目前主要采用同位素放射自顯影法、熒光染料標(biāo)記法、溴化乙錠和銀染法。放射自顯影法具有靈敏度高、可靠性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，?但必須使用同位素標(biāo)記，?操作過(guò)程比較繁瑣，且操作者易遭受同位素輻射的危險(xiǎn)，?需特別的設(shè)備和防護(hù)措施，而且成本昂貴，因而在應(yīng)用中有一定的局限性。熒光染料標(biāo)記法雖然沒(méi)有了同位素對(duì)人的危害性，?但檢測(cè)靈敏度降低了，操作過(guò)程也同樣繁瑣，而且需要有熒光顯微鏡等設(shè)備，成本較高。溴化乙錠(?EB)?染色法方便易行，?但聚丙烯酰胺對(duì)EB的熒光有猝滅作用，?大大降低了溴化乙錠染色靈敏度，特別是EB具有致癌性，?使得對(duì)凝膠的操作和處理變得復(fù)雜。銀染法可以有效地克服以上述多種常見(jiàn)凝膠染色法的缺點(diǎn)，檢測(cè)靈敏度高，使用樣品量少、無(wú)毒無(wú)害、不易擴(kuò)散，易于觀察。傳統(tǒng)的銀染方法主要包含下面幾個(gè)步驟:?(1)預(yù)處理與固定；(2)染色；(3)顯色；(4)終止反應(yīng)等。要用到蒸餾水或去離子水、乙醇、硝酸、硝酸銀、碳酸鈉、甲醛、硫代硫酸鈉、乙酸等多種化學(xué)試劑，整個(gè)過(guò)程比較繁瑣，?所需時(shí)間近2小時(shí)。近年來(lái)，?許多研究人員對(duì)PAGE膠中蛋白質(zhì)和DNA的銀染和顯色的過(guò)程優(yōu)化進(jìn)行了探索，并已取得很大發(fā)展，實(shí)驗(yàn)程序大為簡(jiǎn)化、消耗也更少。

目前DNA分子標(biāo)記、遺傳圖譜構(gòu)建等大量使用PAGE膠。大膠（膠厚：0.4mm，面積：33×52cm²～38×52cm²）使用比較普遍，銀染這樣的大膠，每次染色液、顯色液的量都在2.0～2.5L，試劑消耗較大，且膠板在堿性溶液中浸泡，膠很容易從玻璃板上脫落而全功盡棄。小膠（膠厚：1.0mm，面積：11×20cm²～18×25cm²）也經(jīng)常用到，雖然沒(méi)有脫膠問(wèn)題，但每次染色液、顯色液的量都在0.4～0.6L，試劑消耗也較大。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種試劑用量少，操作簡(jiǎn)便、靈敏，可有效防止脫膠的環(huán)保的聚丙烯酰胺凝膠染色方法。

本發(fā)明的目的在于提供一種聚丙烯酰胺凝膠框定區(qū)域快速染色的方法。

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

一種聚丙烯酰胺凝膠框定區(qū)域快速染色的方法，其特征在于：包括如下步驟：

1）電泳結(jié)束將玻璃膠板取下平放，撬開玻璃板，拿去較短的玻璃板，將長(zhǎng)玻璃板沾有凝膠的一面向上平放；

2）把邊框置于凝膠上，框住需要染色的區(qū)域，將邊框軟質(zhì)面與凝膠緊貼，防止液體的滲漏；在邊框內(nèi)倒入染色液，讓染色液迅速均勻鋪滿整個(gè)需要染色的區(qū)域，進(jìn)行染色；

3）把邊框內(nèi)的染色液倒出，洗去殘留染色液；?

4）再在邊框內(nèi)倒入顯影液，讓顯影液均勻鋪滿整個(gè)需要染色的區(qū)域，進(jìn)行顯色至可看見(jiàn)清晰的條帶；

5）把邊框內(nèi)的顯影液倒出，洗去殘留顯影液，即可。

進(jìn)一步的，步聚2）中所述的邊框?yàn)?層材料構(gòu)成的密閉邊框，與凝膠接觸的為平滑的軟質(zhì)材料層，另一層為硬質(zhì)材料層。

進(jìn)一步的，所述的軟質(zhì)材料選自PVC軟質(zhì)塑料、軟質(zhì)橡膠。

進(jìn)一步的，所述的硬質(zhì)材料選自千思板、環(huán)氧樹脂板、不銹鋼、鋁合金、有機(jī)玻璃、PVC硬質(zhì)塑料。

進(jìn)一步的，所述邊框的軟質(zhì)材料層和硬質(zhì)材料層的厚度獨(dú)立為0.3～0.5cm。

進(jìn)一步的，當(dāng)所配制的凝膠厚度小于0.5mm或凝膠面積大于18×25cm²時(shí)，步聚1）中所述的長(zhǎng)玻璃板在配膠前，將與膠接觸的面涂布親和硅烷，促進(jìn)凝膠與貼合。

進(jìn)一步的，步聚2）中所述染色的時(shí)間為5～10min。

進(jìn)一步的，所述染色液包含0.1～0.2%(w/v)AgNO₃和0.05～0.10%(v/v)?Tween20。

進(jìn)一步的，所述顯影液包含1.0～2.0%(w/v)NaOH、0.04～0.05%?(w/v)Na₂B₄O₇和0.05～0.08M甲醛。