[發(fā)明專利]一種雙光子熒光探針及其制備方法和用途

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310631689.3
• 申請(qǐng)日: 2013-11-29
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103614135A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-03-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孟祥明;葉維鵬;蔡玉磊;汪恕欣;朱滿洲;馮燕
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 安徽大學(xué)
• 主分類號(hào): C09K11/06
• 分類號(hào): C09K11/06;C07D215/14;G01N21/64
• 代理公司: 安徽省合肥新安專利代理有限責(zé)任公司 34101
• 代理人: 喬恒婷

一、技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種雙光子熒光探針、其制備方法及其用途，可以通過(guò)雙光子成像定性檢測(cè)細(xì)胞中半胱氨酸或高半胱氨酸。

二、背景技術(shù)

氨基酸比如半胱氨酸、高半胱氨酸以及谷胱甘肽在生物系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用。他們有著相同的結(jié)構(gòu)式，當(dāng)這些氨基酸的濃度達(dá)到一定程度時(shí)，會(huì)導(dǎo)致一系列的疾病，比如增長(zhǎng)放緩、頭發(fā)褪色、水腫、嗜睡、肝損傷、肌肉和脂肪減少、皮膚病變和阿爾茨海默氏癥。如何檢測(cè)他們是非常重要的并且引起很多科學(xué)家的興趣。然而定性地在細(xì)胞中檢測(cè)氨基酸分子還是很少，因此在體內(nèi)外檢測(cè)氨基酸小分子尤為重要。

熒光探針是在一定體系內(nèi)，當(dāng)一種物質(zhì)或體系中某一物質(zhì)性質(zhì)發(fā)生變化時(shí)，熒光信號(hào)能發(fā)生相應(yīng)改變的分子。熒光光譜由于其檢測(cè)方便，靈敏等優(yōu)點(diǎn)在痕量檢測(cè)中展現(xiàn)了優(yōu)越的性能。

喹啉具有良好的光譜特性和水溶性，并且對(duì)細(xì)胞也是低毒性。因此喹啉是一個(gè)很好的熒光報(bào)告基團(tuán)。喹啉作為熒光團(tuán)已報(bào)道的文獻(xiàn)很多，但大部分局限于單光子熒光探針，雙光子熒光探針報(bào)道甚少。熒光探針對(duì)半胱氨酸/高半胱氨酸檢測(cè)的雙光子熒光探針更為稀少。

目前半胱氨酸/高半胱氨酸檢測(cè)熒光探針大部分為單光子熒光探針，然而單光子熒光探針不僅易使生物本體產(chǎn)生自發(fā)熒光干擾，而且短的激發(fā)波長(zhǎng)還會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生光致毒。近幾年來(lái)，雙光子熒光探針作為一個(gè)科學(xué)家感興趣的研究課題，開(kāi)始逐步替換單光子熒光探針，雙光子熒光探針具有近紅外激發(fā)、暗場(chǎng)成像、避免熒光漂白和光致毒、定靶激發(fā)、高橫向分辨率、降低生物組織吸收系數(shù)及降低組織自發(fā)熒光干擾等優(yōu)點(diǎn)。

三、發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明旨在提供一種雙光子熒光探針及其制備方法和用途，所要解決的技術(shù)問(wèn)題是通過(guò)分子設(shè)計(jì)遴選合適的熒光探針結(jié)構(gòu)，以實(shí)現(xiàn)雙光子成像定性檢測(cè)細(xì)胞中半胱氨酸或高半胱氨酸，具有選擇性專一、靈敏度高、檢測(cè)濃度低的優(yōu)點(diǎn)，細(xì)胞毒性測(cè)試表明本發(fā)明對(duì)細(xì)胞幾乎沒(méi)有毒性作用。

本發(fā)明雙光子熒光探針，是以喹啉為母體，簡(jiǎn)稱熒光探針或熒光探針?lè)肿樱∟Q），其結(jié)構(gòu)由下式表示：

本發(fā)明雙光子熒光探針的制備方法，按以下步驟操作：

（1）將對(duì)碘苯胺15g(68.49mmol)和6mol/L的鹽酸100mL加入反應(yīng)器中，升溫至105℃，待固體完全溶解后向反應(yīng)器中滴加巴豆醛12g(171mmol)，保溫反應(yīng)并用TLC跟蹤至原料反應(yīng)完畢，反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，反應(yīng)液倒入200mL水中，用乙酸乙酯萃取以除掉未反應(yīng)的巴豆醛，水相用氨水中和至pH值為8，再用乙酸乙酯萃取，合并有機(jī)相，有機(jī)相用無(wú)水硫酸鈉干燥并旋蒸后得到粗產(chǎn)物，重結(jié)晶（溶劑為乙酸乙酯和石油醚按體積比1:20構(gòu)成的混合溶劑）后得到中間體1；

（2）將中間體18g(29.74mmol)加入圓底燒瓶中，加入1,4-二氧六環(huán)溶解，隨后加熱至60℃，每隔十分鐘加一次二氧化硒0.82g(7.43mmol)，二氧化硒的加入總量是4.95g，升溫至80℃反應(yīng)2.5小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，過(guò)濾并用1,4-二氧六環(huán)洗滌，收集有機(jī)相，旋蒸后得到粗產(chǎn)物，粗產(chǎn)物用柱層析分離提純（二氯甲烷作為洗脫劑）得到中間體2；

（3）將中間體24g(14.13mmol)、4-（N,N-二甲基）苯乙炔2.08g(14.13mmol)、三苯基磷二氯化鈀0.1g(0.14mmol)、碘化亞銅0.5g（2.6mmol）以及三乙胺10mL加入圓底燒瓶中，加入甲苯溶解，室溫反應(yīng)8小時(shí)，過(guò)濾后收集濾液，將濾液旋蒸后得到粗產(chǎn)物，重結(jié)晶（溶劑為乙酸乙酯和石油醚按體積比1:5構(gòu)成的混合溶劑）后得到雙光子熒光探針NQ。

本發(fā)明熒光探針?lè)肿覰Q的合成過(guò)程如下：

本發(fā)明雙光子熒光探針在定性檢測(cè)細(xì)胞中半胱氨酸或高半胱氨酸時(shí)作為檢測(cè)試劑的應(yīng)用。

將本發(fā)明熒光探針?lè)肿尤苡贒MSO中制得1mM的母液，取250μL的該母液于10mL容量瓶中，再用DMSO定容，配制成25μM。同樣方法取250μL的母液于10mL容量瓶中，然后加入5倍當(dāng)量的半胱氨酸（Cys）或高半胱氨酸（Hcy）。熒光探針單光子和雙光子的激發(fā)波長(zhǎng)分別為395nm和800nm，檢測(cè)485-700nm范圍內(nèi)的熒光光譜變化，隨著時(shí)間的變化，550nm發(fā)射峰逐漸增強(qiáng)（圖3）。