[發明專利]一種原核細胞表達類病毒顆粒的純化方法

有效

• 申請號: 201310629523.8
• 申請日: 2013-11-29
• 公開（公告）號: CN104673760A
• 公開（公告）日: 2015-06-03
• 發明（設計）人: 宋翠靈;李建強;孫洪林;顧月;周童;徐振興;黃紅穎;程曉曉;徐曉威
• 申請（專利權）人: 江蘇先聲藥業有限公司
• 主分類號: C12N7/04
• 分類號: C12N7/04;C07K1/36;C07K1/18;C07K1/34;C07K1/22
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 彭鯤鵬;盧蓓

技術領域

本發明涉及一種原核細胞例如大腸桿菌表達的類病毒顆粒的純化方法。具體的，本發明涉及一種大腸桿菌表達乙肝病毒表面抗原或核心抗原類病毒顆粒的純化方法。

背景技術

類病毒顆粒或者病毒樣顆粒（virus-like?particles，VLPs）是含有某種病毒的一個或多個結構蛋白的空心顆粒，沒有病毒核酸，不能自主復制，在形態上與真正病毒粒子相同或相似，俗稱偽病毒。

近年來發現多數病毒的衣殼蛋白基因在真核表達系統以及少數病毒的衣殼蛋白基因在原核表達系統中都能夠有效地實現自我組裝。這為病毒的基礎研究及疫苗的開發提供了便利條件。由于VLPs沒有感染性，作為免疫原，它可通過和病毒感染一樣的途徑呈遞給免疫細胞，有效地誘導機體的免疫系統產生免疫保護反應。因此，本領域中需要一種優化的大腸桿菌表達的類病毒顆粒的制備和純化方法，尤其需要一種可用于大規模生產的低成本純化方法。

乙肝病毒（HBV）屬于嗜肝DNA病毒（Hepadnaviridae）科，是導致人類肝炎疾病的主要致病因素，每年約有450萬人感染HBV，其中四分之一的人發展成肝病，每年約導致60多萬人死亡（A.R.Zanetti,P.van?Damme,D.Shouval,The?global?impact?of?vaccinationagainst?hepatitis?B:a?historical?overview,Vaccine26(2008)6266–6273.）。HBV主要由外層外膜蛋白表面抗原（HBsAg），以及內層包裹病毒基因組DNA和病毒聚合酶的核心抗原（HBcAg）組成（M.Nassal,H.Schaller,Hepatitis?B?virus?replication,Trends?Microbiol.1(1993)221–228）。在HBV感染的病人體內，最顯著的特征之一是產生較高滴度的針對HBcAg的IgM或者IgG抗體（G.Hess,W.Arnold,The?clinical?relevance?of?the?antibody?to?hepatitis?B?coreantigen(anti-HBc):a?review,J.Virol.Methods2(1980)107–117.）。HBcAg可以自發組裝成類病毒顆粒（VLP），并且在乙肝病人體內誘導T細胞依賴型以及T細胞非依賴型兩種強烈的B細胞、T細胞以及細胞毒T細胞反應（D.R.Milich,A.McLachlan,The?nucleocapsid?of?hepatitis?B?virus?is?both?aT-cell-independent?and?a?T-cell-dependent?antigen,Science234(1986)1398–1401），因此可以應用于預防性或者治療性乙肝疫苗和乙肝病人感染檢測試劑盒的開發（P.Pumpens,R.Ulrich,K.Sasnauskas,A.Kazaks,V.Ose,E.Grens,Constructionof?novel?vaccines?on?the?basis?of?the?virus-like?particles.Hepatitis?B?virusproteins?as?vaccine?carriers,in:Y.Khudyakov(Ed.),Medicinal?ProteinEngineering,CRC?Press,2008,pp.205–248.）。

HBcAg可以自發形成類病毒顆粒，也是目前研究較多的VLP載體，其可作為外源蛋白表位的蛋白載體，同時攜帶多拷貝插入的表位，引起針對外源表位的強烈體液免疫以及細胞免疫效應（P.Pumpens,E.Grens,Determination?of?the?fold?of?the?core?proteinof?hepatitis?B?virus?by?electron?cryomicroscopy,FEBS?Lett.442(1)(1999)1–6.），低溫冷凍電鏡以及X-ray衍射表明HBcAg通過二聚體組裝成T=3或者T=4的顆粒，分別包含180或者240個拷貝的單體，直徑為28nm。由單體組裝成二聚體，然后將由2個α螺旋組成的具有免疫優勢的表位刺突展示在VLP的表面（B.S.A.Wynne,R.A.Crowther,Determination?of?the?foldof?the?core?protein?of?hepatitis?B?virus?by?electron?cryomicroscopy,Nature386(6)(1997)88–91.）。