[發明專利]一種糞腸球菌噬菌體裂解酶及其編碼基因與應用

無效

• 申請號: 201310628789.0
• 申請日: 2013-11-28
• 公開（公告）號: CN103667230A
• 公開（公告）日: 2014-03-26
• 發明（設計）人: 童貽剛;米志強;張文惠;安小平;張志毅;黃勇;李玉元;范航;范華昊
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事醫學科學院微生物流行病研究所
• 主分類號: C12N9/88
• 分類號: C12N9/88;C12N15/60;C12N15/63;A61K38/51;A61P31/04
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及一種糞腸球菌噬菌體裂解酶及其編碼基因與應用。

背景技術

糞腸球菌又叫糞鏈球菌，為革蘭氏陽性菌。根據蘭氏（Lancefield）血清學分類，可將鏈球菌分成許多個群，而糞腸球菌屬于其中的D群。D群鏈球菌又分為腸球菌和非腸球菌，其中腸球菌包括糞腸球菌（S.faecalis）、屎腸球菌（S.faecium）和堅忍腸球菌（S.durans）。近年來，通過DNA-DNA雜交分析發現腸球菌與鏈球菌屬間的同源性較低，故將腸球菌分出，另立為腸球菌屬。與人類感染疾病有關的腸球菌為糞腸球菌（E.faecalis）和屎腸球菌（E.faecium），其中糞腸球菌占90-95%。糞腸球菌形態呈圓形或橢圓形，可順鏈的方向延長，直徑為0.5-1.0um，大多數呈雙或呈短鏈狀排列，一般不運動。在營養豐富的培養基上，其菌落大而光滑，直徑1-2mm。其營養要求低，在普通營養瓊脂培養基上也可生長。糞腸球菌對環境有極強的抵抗能力，能在10℃或45℃的PH值為9.6或NaCl濃度達6.5%的肉湯培養基中生長，可在65℃環境下存活30min。

糞腸球菌是人或動物腸道、口腔和生殖道的正常菌群，正常情況下，共生的糞腸球菌對宿主沒有致病性。當其異位寄生時可引起敗血癥、尿路感染、化膿性腹部感染和心內膜炎等疾病，尤其在獲得了毒力因子或較高水平的抗生素抗性之后，可導致嚴重的細菌感染性疾病，是僅次于葡萄球菌的院內感染革蘭氏陽性球菌。

20世紀70年代，腸球菌主要表現為氨基糖苷類抗生素耐藥，隨著抗生素的不斷更新換代，首例耐萬古霉素腸球菌（VRE）在1986年被發現，90年代以來，抗菌藥物應用的普遍化、頭孢菌素類和氟喹諾酮類藥物的過度使用以及介入性治療等因素，導致耐藥腸球菌所致感染病例不斷增加。近年來，伴隨著院內感染率的上升，糞腸球菌的耐藥范圍愈加擴大。萬古霉素曾被認為是對付耐藥菌的最后一道防線，但隨著耐萬古霉素糞腸球菌的頻繁出現及該種抗性在菌株間的迅速傳播，對人類的健康已經造成嚴重威脅，也向臨床治療耐藥糞腸球菌提出了極大的挑戰。

隨著抗生素的濫用現象日益嚴重，細菌的耐藥性問題日益加劇，新抗生素的研發速度遠遠趕不上耐藥菌的產生速度，尋找新的抗菌制劑刻不容緩。而噬菌體及其裂解酶因其高效的殺菌能力及高度的宿主專一性而成為新一代抗菌制劑的候選之一，對于噬菌體及其裂解酶的研究在近些年被許多研究者提上日程。

噬菌體是一類以微生物（包括細菌、真菌、放線菌或螺旋體等）為宿主的病毒，沒有細胞結構，僅由衣殼蛋白和其內部的遺傳物質組成，必須依賴宿主進行復制和增殖。噬菌體是細菌的天然殺手，廣泛存在于自然界中，是自然界中數量最大的生物類群，有人估計自然界中存在10³⁰-10³²株、上億種不同型別的噬菌體。

相對于傳統的抗生素治療細菌感染，噬菌體治療具有其獨特的優勢：能自我擴增，消滅病原菌之后自我死亡；特異性強，只針對特定的病原菌，對人體、動植物和環境沒有任何毒副作用等。

除了活噬菌體制劑，來源于噬菌體的裂解酶也是防治細菌性疾病的另一種手段。噬菌體裂解酶在噬菌體裂解細菌的過程中水解細菌細胞壁肽聚糖，從而破壞細胞壁釋放子代噬菌體，作為潛在的新型殺菌劑，它具有抗生素所無法比擬的優勢。噬菌體裂解酶的殺菌機制與抗生素完全不同，細菌的細胞壁肽聚糖結構在細菌的進化過程中十分保守，因此裂解酶導致細菌耐藥性的可能性遠小于抗生素。

發明內容

本發明的目的是提供一種糞腸球菌噬菌體裂解酶及其編碼基因與應用。

本發明所提供的糞腸球菌噬菌體裂解酶，名稱為Lysin-EF1，來源于糞腸球菌噬菌體（Enterococcus?faecalis?bacteriophage）IME-EF1，具體可為如下（a）或（b）：

（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質；

（b）將序列1的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有具有裂解糞腸球菌功能的由序列1衍生的蛋白質。

上述（b）中的蛋白質可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。上述（b）中的蛋白質的編碼基因可通過將序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變。

其中，序列表中序列1由237個氨基酸殘基組成。

編碼所述Lysin-EF1蛋白的核酸分子也屬于本發明的保護范圍。