[發明專利]一種從羊胰臟中提取糜蛋白酶的方法

無效

• 申請號: 201310625721.7
• 申請日: 2013-11-24
• 公開（公告）號: CN103725665A
• 公開（公告）日: 2014-04-16
• 發明（設計）人: 劉乃山;李靜潔;劉君;劉翠珍
• 申請（專利權）人: 青島康原藥業有限公司
• 主分類號: C12N9/76
• 分類號: C12N9/76
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于生物制藥領域，設計藥用糜蛋白酶的生化分離技術。具體地說是采用鹽析、多重結晶結合透析等技術來提取糜蛋白酶。?

背景技術

糜蛋白酶是從牛胰腺或豬胰腺等哺乳動物胰腺中分離純化得到的一種蛋白酶。它在藥理和臨床上的功用主要有兩方面：一、消炎：對各種炎癥、炎性水腫、血腫、潰瘍及血栓等有較好療效。二、抗癌：能促進抗癌藥物向病灶滲透，促使化療藥物發揮作用，局部大劑量使用時作用更強。大劑量使用可治療多種腫瘤，如乳腺癌、宮頸癌、胃癌等，并且無任何毒副作用或不良反應。?

目前中國市場上生產糜蛋白酶的廠家有十幾家，但多采用傳統工藝法生產，制備的糜蛋白酶效價低，而且不穩定。中國專利CN1944641A公開了一種糜蛋白酶的制備方法，采用親和層析工藝從糜蛋白酶原生產高純度糜蛋白酶，但是正如中國專利CN1013025B分析，也存在一些缺點，最主要的，親和層析介質昂貴，可重復使用次數少，介質的使用量大，不適合規模化大生產。而中國專利CN1013025B雖然解決了親和層析的不足，也能獲得高比活的糜蛋白酶，但同樣，比較起傳統工藝來，生產成本太高。在原料的選擇上，中國的廠家亦局限于采用牛胰臟或豬胰臟制備糜蛋白酶。可是隨著糜蛋白酶的應用廣泛，使得國際市場對本產品的需求不斷擴大，質量要求上更加嚴格，要求產品有更高的質量：《中國藥典》(2010版)規定，糜蛋白酶的效價不得少于1000單位/毫克。針對市場需求的擴大和效價提高的要求，本發明采用羊胰臟為原料，對傳統工藝進行了改進和創新。?

發明內容

本發明的目的就是為了生產高質量的糜蛋白酶而又降低生產成本，對傳統工藝加以改造，尤其是參數的改造，提供了一種從羊胰臟中提取糜蛋白酶的方法，該方法包括如下步驟：?

1、糜蛋白酶粗制生產操作：?

(1)新鮮的羊胰臟，立即用鑷子和剪刀將脂肪結締組織等除去，置絞碎機中絞碎，稱重。?

(2)絞碎物置塑料桶中，按1～3ml/g的比例加入0.125mol/L硫酸溶液浸漬20～30小時，在浸漬期中每小時攪拌1次。?

(3)將浸漬物置濾袋過濾，濾渣再按1～2ml/g的比例加入0.125mol/L硫酸溶液浸漬1～3小時，濾干后棄去濾渣。?

(4)將兩次浸漬液合并置塑料桶中，每1000ml溶液中加入固體硫酸銨242g，使達40％飽和度，靜置12～16小時。?

(5)過濾，留取過濾液，固體棄去。?

(6)在每1000ml清液中加入固體硫酸銨205g，使達70％飽和度，放置12～16小時。?

(7)過濾，留取固體，棄濾液。?

(8)將沉淀物按2～4ml/g的比例加水溶解，再按(4)(5)(6)(7)操作法分次加固體硫酸銨近40％和70％飽和度沉淀。?

(9)取70％飽和度沉淀物，按1～3ml/g的比例加水溶解，再按0.2～?1.5ml/g的比例加入飽和硫酸銨溶液，調pH值至4.0～5.0。?

(10)將溶液靜置20～28℃恒溫箱中40～50小時，即有針狀結晶(糜蛋白酶粗品)析出。抽濾，即得糜蛋白酶粗品。?

2、糜蛋白酶精制生產操作：?

(1)結晶工序?

投料：取糜蛋白酶粗品，置不銹鋼桶內，按5～9ml/g的比例加水溶解，調pH值至2.5～3.5，攪拌8～10小時后，靜置12～16小時。?

結晶I?

靜置結束后攪拌，并調pH值至2.0～3.0。按1～3ml/g的比例加入飽和硫酸銨溶液，攪拌10～30分鐘，調pH值至4.0～5.0，置20～28℃條件下，保溫40～48小時，過濾，收集濾餅，濾液棄去。?

結晶II?

按2～4ml/g的比例加入水溶解濾餅，調pH值至2.0～3.0，再按0.5～2.0ml/g的比例加入飽和硫酸銨溶液，調pH值至4.0～5.0，置20～28℃條件下，保溫20～24小時，過濾，收集濾餅。?

結晶III?

按2～4ml/g的比例加入水溶解濾餅，調pH值至2.0～3.0，再按0.5～2.0ml/g的比例加入飽和硫酸銨溶液，調pH值至4.0～5.0，置?20～28℃條件下，保溫20～24小時，過濾，收集濾餅。?

結晶IV?

按2～4ml/g的比例加入水溶解濾餅，調pH值至2.0～3.0，再按0.5～2.0ml/g的比例加入飽和硫酸銨溶液，調pH值至4.0～5.0，置20～28℃條件下，保溫20～24小時，過濾，收集濾餅。?

(2)活化工序?