[發(fā)明專利]H1型流感病毒等溫?cái)U(kuò)增檢測試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310625455.8
• 申請日: 2013-11-28
• 公開（公告）號: CN103911460A
• 公開（公告）日: 2014-07-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 彭濤;龍飛;蘇文瀚;肖靜;殷仙麗;盧然如
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院;佛山市燁泰科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 廣州市越秀區(qū)海心聯(lián)合專利代理事務(wù)所(普通合伙) 44295
• 代理人: 任琳

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明公開了一種檢測流感病毒的試劑盒，具體地說，是一種檢測H1型流感病毒等溫?cái)U(kuò)增的試劑盒。

背景技術(shù)

流行性感冒簡稱流感,主要是指人群中，由普通流感病毒引起的一種病毒性急性呼吸道傳染病。流感傳染性強(qiáng)，傳染迅速，會導(dǎo)致每年的流行，并且歷史上每隔幾十年會造成流感大流行，在短時(shí)間內(nèi)使很多人患病甚至死亡。流感病毒可分為甲（A）、乙（B）、丙（C）三型。其特點(diǎn)是容易發(fā)生變異，其中甲型流感病毒最容易發(fā)生變異，可感染人和多種動物，為人類流感的主要病原，常引起大流行和中小流行。對流感疫情的防控最根本的途徑就是早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療和切斷傳染源。由此可見，快速靈敏的流感病毒檢測技術(shù)成為了保護(hù)人民生命健康、防控疫情在國內(nèi)大范圍流行的第一道屏障。

現(xiàn)有的快速檢測技術(shù)主要有兩類：第一類為免疫學(xué)方法，包括酶聯(lián)免疫吸附法、免疫熒光法、同位素標(biāo)記抗體法、乳膠凝集法、免疫傳感器法、免疫擴(kuò)散法及免疫色譜法等；第二類是以核酸為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)方法，主要有核酸探針法和聚合酶鏈反應(yīng)法（Polymerase?Chain?Reaction，PCR）。其中的PCR方法是核酸擴(kuò)增技術(shù)的典型代表，該技術(shù)是由美國PE-Cetus公司人類遺傳研究室的Mullin等人于1985年發(fā)明的，在過去的二十年里，PCR技術(shù)作為分子生物學(xué)的核心得到了迅猛的發(fā)展和應(yīng)用，特別是在疾病的臨床診斷中，PCR技術(shù)以其快速、靈敏和特異的優(yōu)勢，不僅日益取代了傳統(tǒng)的診斷方法，而且使以往無法完成的診斷成為了可能。

盡管PCR技術(shù)長期以來占據(jù)著核酸擴(kuò)增壟斷技術(shù)的地位，新近研發(fā)的一系列等溫核酸擴(kuò)增檢測技術(shù)正逐漸成為PCR技術(shù)的替代技術(shù)而被廣泛應(yīng)用。與PCR技術(shù)相比，核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的特點(diǎn)是可在特定溫度條件下實(shí)現(xiàn)核酸的擴(kuò)增。由于擴(kuò)增反應(yīng)的全過程均在同一溫度下進(jìn)行，使它們對儀器的要求大大簡化，可通過加熱模塊、水浴槽等簡單的，甚至是非專業(yè)的設(shè)備完成反應(yīng)。目前常用的等溫技術(shù)有以下幾類：

1、依賴核酸序列擴(kuò)增（Nucleic?acid?sequence-based?amplification，NASBA）2、自主序列復(fù)制（Self-sustained?Sequence?Replication，3SR）

3、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增（Transcription?mediated?amplification，TMA）

4、單引物等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Single?Primer?Isothermal?Amplification，SPIA）

5、滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)（rolling?circle?amplification，RCA）

6、環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loop-mediated?isothermal?amplification，LAMP）

7、鏈替代擴(kuò)增技術(shù)（Strand?displacement?amplification，SDA）

這些核酸擴(kuò)增技術(shù)（PCR技術(shù)、等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)等）的擴(kuò)增產(chǎn)物為DNA或RNA，與之相對應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物檢測方法主要有以下幾種：

電泳分析：常規(guī)變性凝膠電泳后用EB或SYBR?Green?Ⅰ染色，在1%-1.5%瓊脂糖凝膠中可以輕易識別。目前該方法已很少使用；

雜交技術(shù)：產(chǎn)物通過與特異性探針標(biāo)記的序列雜交，如32P標(biāo)記的寡核苷酸序列與擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行Northern雜交以檢測擴(kuò)增產(chǎn)物；

酶聯(lián)凝膠（enzyme-linked?gel?assay，ELGA）技術(shù)：用非放射性的辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的探針檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。未雜交的探針通過在垂直凝膠電泳中得以分離，然后將凝膠置于有HRP底物的溶液中孵育，則可目測反應(yīng)結(jié)果；

電化學(xué)發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）技術(shù)：5’端標(biāo)記有生物素的捕獲探針將擴(kuò)增產(chǎn)物固定在鏈霉親和素結(jié)合的磁珠上，下游引物的5’末端含有和釘標(biāo)電化學(xué)發(fā)光檢測探針互補(bǔ)的序列。擴(kuò)增產(chǎn)物與ECL探針形成復(fù)合物，攜帶該復(fù)合物的磁珠被電極的表面磁性捕獲。電極上的電壓引起電化學(xué)發(fā)光（ECL）反應(yīng)。已雜交上的釘標(biāo)磁珠發(fā)出的光和擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)生的RNA擴(kuò)增產(chǎn)物總量成比例對應(yīng)，由此可以對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測和定量；