[發明專利]一種利用斑馬魚測試典型抗生素廢水毒性的方法

無效

• 申請號: 201310625401.1
• 申請日: 2013-11-28
• 公開（公告）號: CN103616489A
• 公開（公告）日: 2014-03-05
• 發明（設計）人: 沈洪艷;楊雷;武晨虹
• 申請（專利權）人: 河北科技大學
• 主分類號: G01N33/18
• 分類號: G01N33/18
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 朱江嶺

1.一種利用斑馬魚測試典型抗生素廢水毒性的方法，其特征是，

該方法采用斑馬魚體內試驗方法，分別利用短期即96小時和長期即20天的暴露方式描述典型抗生素廢水對斑馬魚的急性毒性和亞急性毒性，判斷典型抗生素廢水對斑馬魚是否具有毒性的判據為：急性毒性以96h?LC₅₀描述；亞急性毒性以一組抗氧化指標描述；

利用短期暴露方式，測定得到典型抗生素廢水對斑馬魚的急性毒性，急性毒性測定得到96h?LC₅₀；以96h?LC₅₀描述急性毒性；

利用長期暴露方式，亞急性毒性以魚體的一組抗氧化指標表示，然后利用顯著性t檢驗，檢驗暴露組與空白對照組間的差異，當t＜t_0.05(n)，即P＞0.05時，認為無顯著性差異；當t_0.05(n)≤t＜t_0.01(n)，即0.01＜P≤0.05時，認為差異顯著；當t＞t_0.01(n)，即P≤0.01時，認為差異極顯著；

本測試方法為，如果暴露組與空白對照組差異顯著，即0.01<P<0.05或者P<0.01時，則認為典型抗生素廢水有亞急性生物毒性，若暴露組與空白對照組差異不顯著，則認為典型抗生素廢水無亞急性生物毒性。

2.如權利要求1所述的利用斑馬魚測試典型抗生素廢水毒性的方法，其特征是，它包括以下具體步驟：

(1)準備測試生物，選用斑馬魚為受試生物，雌雄個體各半，斑馬魚經5%食鹽水消毒后，用曝氣48h的脫氯自來水在實驗室馴養7天，在預實驗前一天和試驗期間不予喂食，避免魚餌對測試結果產生影響；

(2)準備測試條件，試驗溶液pH值為7.0～8.5；總硬度以CaCO₃計為240～250mg/L，試驗溫度為23～25℃；溶解氧高于5mg/L；采用自然光照；試驗周期為96h或20d；試驗方式為靜水式，即每24h更換一次試液，每天至少測定1次試驗溶液的水溫、硬度、pH值、溶解氧含量；

(3)進行預實驗，在50cm×20cm×25cm的玻璃水族缸中，盛放20L試驗溶液，分為5～6個暴露組，暴露組濃度以試驗溶液中含典型抗生素廢水的體積百分比表示。三種典型抗生素廢水暴露組分別設置如下：青霉素廢水暴露濃度組為5%、10%、15%、20%、25%和30%；土霉素廢水暴露濃度組為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%和0.6%；鏈霉素廢水暴露濃度組為1%、3.2%、10%、32%、100%；不設平行組，每個暴露組放5尾斑馬魚，連續實驗96h，每日至少兩次記錄各容器內的死魚數并及時取出死魚；計算得出預實驗結果：最低的24h絕對致死濃度和最高的96h無死亡濃度；

青霉素廢水預實驗結果：最低的24h絕對致死濃度和最高的96h無死亡濃度分別為20%和10%；

土霉素廢水預實驗結果：最低的24h絕對致死濃度和最高的96h無死亡濃度分別為0.1%和0.5%；

鏈霉素廢水預實驗結果：最低的24h絕對致死濃度和最高的96h無死亡濃度分別為100%和10%；

(4)急性毒性測試方法根據所述步驟（3）的測試結果，在24h絕對致死濃度和最高的96h無死亡濃度之間按等對數間距設置5個暴露組，暴露組濃度以試驗溶液中含典型抗生素廢水的體積百分比表示。三種典型抗生素廢水暴露組分別設置如下：青霉素廢水暴露濃度組為10%、12.57%、15.81%、19.88%、24.99%；土霉素廢水暴露濃度組為0.1%、0.15%、0.22%、0.33%、0.5%；鏈霉素廢水暴露濃度組為17.78%、23.71%、31.62%、42.17%、56.23%；每個暴露組設2個平行組，并設置空白對照組，共計11個組，每個暴露組隨機放入8尾斑馬魚，試驗周期為96h，試驗結果以半數致死濃度表示，每隔24h更換1次試驗溶液，采用寇式法和概率單位法兩種方法計算得出96h?LC₅₀及其95%的置信限；

急性毒性測試結果為：青霉素廢水96h?LC₅₀為以寇式法計算的13.46%和以概率單位法計算的13.66%；土霉素廢水96h?LC₅₀為以寇式法計算的0.22%和以概率單位法計算的0.19%；鏈霉素廢水96h?LC₅₀為以寇式法計算的25.56%和以概率單位法計算的29.51%；

(5)亞急性毒性測試方法參照步驟（4）的測試結果設置亞急性的暴露組，暴露組濃度在1/6?96h?LC₅₀和1/2?96h?LC₅₀之間，設置5個暴露組，青霉素廢水、土霉素和鏈霉素暴露濃度組均為1/256?96h?LC₅₀、1/64?96hLC₅₀、1/16?96h?LC₅₀、1/4?96h?LC₅₀、1/2?96h?LC₅₀，暴露組濃度以試驗溶液中含典型抗生素廢水的體積百分比表示，每個暴露組設置2個平行組，1個空白對照組，共計16個組。暴露時間為20天，選取健康的斑馬魚，雌雄個體各半，每個組15尾斑馬魚，每天換水。5個暴露組分別于第4、8、12、16和20天取生物樣進行分析，每次各暴露組分別取2尾斑馬魚，測定POD活性、SOD活性和MDA含量，測試結果為暴露組與空白對照組相比，POD活性、SOD活性和MDA含量有顯著差異；

所述試驗溶液為典型抗生素廢水和除氯自來水的混合溶液。