[發明專利]黃曲霉毒素B1的線性十二肽抗原模擬表位及其應用

有效

• 申請號: 201310621194.2
• 申請日: 2012-12-21
• 公開（公告）號: CN103848895B
• 公開（公告）日: 2017-10-31
• 發明（設計）人: 何慶華;許楊
• 申請（專利權）人: 南昌大學
• 主分類號: C07K7/08
• 分類號: C07K7/08;C12N15/31;C12P21/02;C12N15/63;G01N33/68
• 代理公司: 南昌新天下專利商標代理有限公司36115
• 代理人: 施秀瑾

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及黃曲霉毒素B₁抗原模擬表位及其應用。

背景技術

黃曲霉毒素B₁(aflatoxin B₁，AFB₁)是主要由黃曲霉和寄生曲霉產生的次級代謝產物，廣泛存在于花生、棉籽、玉米、小麥和稻米等農作物中。AFB₁對人及動物肝臟組織有破壞作用，嚴重時可導致肝癌甚至死亡，1993年被WHO的癌癥研究機構劃定為I類致癌物。因此，食品中AFB₁的檢測對于人類健康意義重大。

目前，檢測食品中AFB₁的方法主要有高效液相色譜、氣相色譜、薄層色譜及免疫學檢測等方法，免疫學檢測方法以其靈敏度高、檢測方便、成本低廉等優勢在AFB₁的檢測中得到了廣泛的應用。然而，在建立免疫學檢測方法的過程中，必須使用AFB₁標準品為原料來制備競爭抗原或者固相包被抗原，AFB₁不僅價格昂貴而且具有極強的致癌性，對檢測人員的健康和環境造成極大的威脅，從而在一定程度上制約了免疫學檢測方法的應用和推廣。有鑒于此，人們開始采用抗獨特型抗體及抗原模擬表位技術來實現有害小分子物質標準品的替代，并取得了一定的進展。噬菌體展示肽庫技術的主要特點是可有效地篩選出與目標靶體特異結合的噬菌體展示多肽，該技術在探索受體與配體之間相互作用結合位點、尋求高親和力生物活性的配體分子、探索未知蛋白質空間結構表位、新型疫苗的研制等方面應用廣泛。

本發明通過用噬菌體展示肽庫技術，從肽庫中篩選出能與靶分子（抗AFB₁單克隆抗體）特異性結合的多肽（抗原模擬表位），該抗原模擬表位具有與天然AFB₁分子相似的免疫反應特性，通過獲得的AFB₁抗原模擬表位，以代替價格昂貴且毒性強的AFB₁標準品，并作為競爭抗原或固相包被抗原應用于AFB₁的免疫學檢測。

發明內容

本發明以抗AFB₁單克隆抗體為靶分子，將靶分子固相包被于酶標板上，分別投入噬菌體隨機展示環七、十二肽庫，分別進行親和淘選，獲得了兩種AFB₁的抗原模擬表位（環七肽及十二肽各1種）。它們的氨基酸序列如下：

AFB₁抗原模擬表位1：從噬菌體隨機環七肽庫中篩選的AFB₁抗原模擬表位（多肽），其氨基酸序列為：CDPRKHIHC。

AFB₁抗原模擬表位2：從噬菌體隨機十二肽庫中篩選的AFB₁抗原模擬表位（多肽），其氨基酸序列為：VPYSPHYFERMI。

本發明還涉及編碼上述抗原模擬表位氨基酸序列的核苷酸序列，優選為GAT CCG CGT AAG CAT ATT CAT或GTT CCG TAT TCG CCT CAT TAT TTT GAG CGT ATG ATT。

上述抗原模擬表位（多肽）結構中，大寫英文字母分別代表二十一種已知天然L-型氨基酸殘基或其D-型異構體的一種，即C代表半胱氨酸殘基，D代表天冬氨酸殘基，P代表脯氨酸殘基，R代表精氨酸殘基，K代表賴氨酸殘基，H代表組氨酸殘基，I代表異亮氨酸殘基，V代表纈氨酸殘基，Y代表酪氨酸殘基，S代表絲氨酸殘基，F代表苯丙氨酸殘基，E代表谷氨酸殘基，M代表甲硫氨酸殘基。模擬表位1的N末端和C末端的兩個半胱氨酸殘基形成分子內二硫鍵，為環狀結構。

本發明提及的AFB₁抗原模擬表位（多肽）可通過噬菌體擴增、化學合成或基因工程重組表達

的方式進行大量制備。噬菌體擴增是指將展示有AFB₁抗原模擬表位（多肽）的噬菌體，通過生物擴增的方式，大量繁殖生產展示有AFB₁抗原模擬表位（多肽）的噬菌體粒子。化學合成是指依據公布的模擬表位1、模擬表位2的氨基酸序列，通過化學合成多肽的方式進行多肽合成。基因工程重組表達的方式是指將編碼模擬表位1或模擬表位2的基因，通過克隆至表達載體，以多肽-融合蛋白的形式進行AFB₁抗原模擬表位的大量制備。

本發明還涉及所述黃曲霉素B₁抗原模擬表位在免疫學檢測分析中的應用。免疫學檢測的類型包括酶聯免疫吸附檢測、膠體金免疫層析、免疫斑點雜交等基于抗原-抗體特異性反應的免疫學分析檢測類型。