[發明專利]豬帶絳蟲TSOL18基因重組雙歧桿菌疫苗制備及鑒定方法

無效

• 申請號: 201310617141.3
• 申請日: 2013-11-29
• 公開（公告）號: CN103623397A
• 公開（公告）日: 2014-03-12
• 發明（設計）人: 周必英
• 申請（專利權）人: 遵義醫學院
• 主分類號: A61K39/00
• 分類號: A61K39/00;C12N1/21;C12N15/74;C12N15/12;C12Q1/68;A61P33/10
• 代理公司: 貴陽中新專利商標事務所 52100
• 代理人: 吳無懼

技術領域

本發明涉及豬帶絳蟲TSOL18基因重組雙歧桿菌疫苗制備及鑒定方法。

背景技術

豬囊尾蚴病（Cysticercosis?cellulosae）又稱囊蟲病（Cysticercosis），是由豬帶絳蟲（Taenia?solium）的中絳期幼蟲寄生在人體皮下、肌肉、腦、眼等臟器引起的一種嚴重危害人類健康的人畜共患寄生蟲病，已成為全球性的公共衛生問題，我國也是豬囊尾蚴病高發國家之一，以東北、華北、西北、西南地區發病率較高，全國約有200萬～300萬囊蟲病患者，感染率為0.14%～3.20%。藥物及手術治療都有其局限性，研制疫苗防治該病已成為當前研究熱點。

TSOL18基因是豬帶絳蟲六鉤蚴階段重要的免疫原基因，被認為是最具前景的疫苗候選基因。雙歧桿菌(Bifidobacteria,Bb)是人和哺乳動物腸道內重要的益生菌，具有抗菌、抑瘤、免疫調節和營養等多種生理作用。近年來，隨著基因工程技術的發展，以Bb為載體傳遞系統，已在細菌、病毒、腫瘤等領域構建了一系列重組雙歧桿菌。而在寄生蟲領域方面，尚未見豬帶絳蟲重組Bb的報道，因此，本研究擬通過全基因合成豬帶絳蟲TSOL18基因，將其定向克隆到大腸桿菌-雙歧桿菌穿梭表達載體pGEX-1λT中，構建重組質粒pGEX-TSOL18，電穿孔轉化長雙歧桿菌(B.longum)，構建豬帶絳蟲重組Bb(pGEX-TSOL18)疫苗，為豬囊尾蚴病的防治提供一種有價值的新型疫苗。

發明內容

本發明要解決的技術問題是：提供一種豬帶絳蟲TSOL18基因重組雙歧桿菌疫苗制備方法，以解決現有技術中還沒有研究出豬帶絳蟲重組Bb的問題。

本發明的技術方案是：一種豬帶絳蟲TSOL18基因重組雙歧桿菌疫苗制備及鑒定方法，包括以下步驟：

（1）TSOL18基因合成和引物設計：根據豬帶絳蟲TSOL18基因序列，通過全基因合成的方法，設計全長拼接引物，在引物的兩端分別加入BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位點和保護性堿基，合成長度為393bp的TSOL18基因；?

（2）重組質粒pGEX-TSOL18的構建及鑒定：合成基因的PCR產物與克隆載體pMD18-T在T4DNA連接酶作用下，連接，連接產物轉化至E.coli?Top10感受態細胞，冰浴，水浴，冰浴冷卻后加入LB培養液，振搖，離心，棄上清，剩余200μl混勻涂于含Amp的LB瓊脂平板上，倒置培養12～16h；挑取單菌落至含氨芐青霉素的LB培養液中，振搖培養，提取質粒，進行PCR鑒定；然后將重組質粒pMD18-T-TSOL18與表達載體pGEX-1λT分別用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切，膠回收相應片段后用T4DNA連接酶連接，轉化至E.coli?DH5α感受態細胞，挑取陽性克隆，抽提質粒，進行酶切和測序鑒定；

（3）豬帶絳蟲重組Bb(pGEX-TSOL18)疫苗的構建及鑒定

①B.longum感受態細菌的制備：將B.longum凍干粉用無菌水充分溶解后，涂布于MRS瓊脂平板上，厭氧培養24～72h，使其充分活化；挑取活化的單菌落，接種于MRS液體培養中厭氧培養；然后按1:25比例接種于含蔗糖的MRS培養基中，厭氧培養24～72h；冰浴，離心，棄上清，沉淀用預冷的蔗糖清洗，再用蔗糖緩沖液重懸；此細菌可立即用于電轉化，或者加入預冷的甘油，-80℃凍存備用；

②重組質粒pGEX-TSOL18電轉化B.longum感受態細菌：取備用的重組質粒pGEX-TSOL18與B.longum感受態細菌混勻，冰浴10～15min后轉移至電擊杯中進行電擊，電擊完畢后立即將混合液轉入到MRS液體培養基中厭氧培養；將菌液涂布于含氨芐青霉素的MRS瓊脂平板上，厭氧培養24～72h；?

③豬帶絳蟲重組Bb(pGEX-TSOL18)疫苗的鑒定：挑取上述平板中單個菌落至含氨芐青霉素的MRS培養基中，厭氧培養24～72h；將菌液離心，棄上清，沉淀中加入蔗糖溶液重溶菌體沉淀，溫浴，期間振蕩使其充分反應，抽提質粒，進行酶切、PCR和測序鑒定。

所述的步驟②中電擊參數設置為：電壓1.25KV、場強12.5?KV/cm、電容25μF、電阻200Ω、轉化時間5ms。