[發(fā)明專利]喜樹堿在制備抗溶裂期EB病毒藥物中的應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310616433.5
• 申請日: 2013-11-27
• 公開（公告）號: CN104666301A
• 公開（公告）日: 2015-06-03
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王蒲;唐超;鄒軍輝;萬曉春
• 申請（專利權(quán)）人: 深圳先進技術(shù)研究院
• 主分類號: A61K31/4745
• 分類號: A61K31/4745;A61P31/22;A61P35/00
• 代理公司: 深圳市科進知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 44316
• 代理人: 沈祖鋒;郝明琴

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及喜樹堿應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及喜樹堿在制備抗溶裂期EB病毒藥物中的應(yīng)用。?

背景技術(shù)

EB（Epstein-Barr）病毒是皰疹病毒科γ亞科成員中唯一能引起人類感染的淋巴濾泡病毒（lymphocrypovirus），是一種在人群中分布廣泛的感染因子。EB病毒具有嗜B淋巴細胞的特征，能夠在B淋巴細胞中建立隱形感染，刺激細胞的增生和轉(zhuǎn)化，主要以多拷貝環(huán)狀DNA形式游離于胞漿中，并整合至宿主染色體內(nèi)，在一定的信號通路刺激下可導(dǎo)致B淋巴細胞轉(zhuǎn)化成槳細胞，使EB病毒產(chǎn)生具有感染性的病毒顆粒，最終導(dǎo)致宿主細胞的溶解和死亡。近年來發(fā)現(xiàn)，在人類的腮腺管、口咽部及宮頸外口處上皮細胞表面均發(fā)現(xiàn)類似EB病毒受體的結(jié)構(gòu)。EB病毒是傳染性單核細胞增多癥的病原體，EB病毒科引起單核細胞增多癥，鼻咽癌，Burkitt’氏淋巴瘤，霍奇金?。℉odgkin’sdisease，HD），口腔腺體腫瘤，胸腺瘤，器官移植后B細胞淋巴瘤等。?

EB病毒在感染細胞中的生活周期可以分為潛伏期和溶裂期，其中溶裂期又分為立即早期、早期、病毒DNA復(fù)制期和晚期。在溶裂期感染時，環(huán)狀的病毒基因組解環(huán)形成線狀的DNA，病毒立即早期基因BZLF1最先表達生產(chǎn)出Zta蛋白，Zta可與DNA特異序列結(jié)合，其轉(zhuǎn)錄激活作用是通過與順式作用元件中的Z反應(yīng)元件（Zeta?response?element，ZRE）DNA結(jié)合蛋白基序結(jié)合而反式激活大量的EB病毒早期基因，從而引發(fā)EB病毒溶裂復(fù)制的連鎖效應(yīng)，使EB病毒進入溶裂期，綜上所述，Zta蛋白在溶裂期感染基因組的轉(zhuǎn)錄和表達過程中起著重要作用。而Zta蛋白在與復(fù)制起始位點（OriLyt）DNA結(jié)合的過程中，受到拓撲異構(gòu)酶I的調(diào)節(jié)。?

喜樹堿是一種從喜樹（Camptotheca?acuminata）中分離出來的生物堿，它是?一種針對細胞核內(nèi)拓撲異構(gòu)酶I的一種很有前景的抗腫瘤藥物（Bomgaars?et?al，2001）。喜樹堿通過作用于拓撲異構(gòu)酶I來抑制DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和有絲分裂?，F(xiàn)有技術(shù)中，喜樹堿類抗癌藥物有許多優(yōu)點，如抗腫瘤譜廣、與其它抗腫瘤藥物無交叉耐藥性，對肺癌、前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌、宮頸癌、結(jié)腸癌、胃癌以及皮膚癌等都有抑制腫瘤細胞的作用。但喜樹堿在制備抗溶裂期EB病毒藥物中的應(yīng)用還未見報道。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供喜樹堿在制備抗溶裂期EB病毒藥物中的應(yīng)用及喜樹堿在制備預(yù)防EB病毒感染引起的癌癥的藥物中的應(yīng)用。?

具體地，本發(fā)明的技術(shù)方案包括：喜樹堿在制備抗溶裂期EB病毒藥物中的應(yīng)用。優(yōu)選的實施例中，EB病毒在感染細胞中處于早期；或者EB病毒在感染細胞中處于立即早期。?

優(yōu)選的實施例中，感染細胞5×10⁵-10×10⁵個/毫升時，喜樹堿的使用量可以0.1-2.0納摩爾，進一步優(yōu)選為1.0-2.0納摩爾；或者為0.1-0.9納摩爾，進一步優(yōu)選為0.3-0.9納摩爾，更進一步優(yōu)選為0.3納摩爾。?

本發(fā)明的技術(shù)方案還包括：喜樹堿在制備預(yù)防EB病毒感染引起的癌癥的藥物中的應(yīng)用。優(yōu)選的實施例中，所述EB病毒感染引起的癌癥為鼻咽癌、Burkitt’氏淋巴瘤、霍奇金病、胃癌或胸腺瘤。?

本發(fā)明的技術(shù)要點是：?

步驟1、ZKO-293細胞的培養(yǎng)?

ZKO-293細胞于37℃，5%二氧化碳，PH7.2-7.4環(huán)境中，加入含有10%胎牛血清和100μg/ml潮霉素RPMI血清中培養(yǎng)；?

步驟2、立即早期EB病毒感染細胞和早期EB病毒感染細胞的構(gòu)建?

Zta真核載體轉(zhuǎn)染：將Hp-熒光素酶質(zhì)粒與p3xFLAG-Zta共轉(zhuǎn)入ZKO-293細胞中轉(zhuǎn)化6h，并以Hp-熒光素酶質(zhì)粒與p3xFLAG質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入ZKO-293細胞作為對照，對熒光素酶進行檢測判斷真核載體是否轉(zhuǎn)染成功；?

挑選上述Zta蛋白免疫印跡陽性、mDBP蛋白免疫印跡陽性、VCA蛋白免疫印跡陰性的ZKO-293細胞作為早期EB病毒感染細胞；?

挑選上述Zta蛋白免疫印跡陽性、mDBP蛋白免疫印跡陰性、VCA蛋白免疫印跡陰性的ZKO-293細胞作為立即早期EB病毒感染細胞；?

步驟3、加入喜樹堿處理?

將上述早期EB病毒感染細胞或立即早期EB病毒感染細胞調(diào)整細胞密度為5×10⁵-10×10⁵個/毫升，加入不同濃度的喜樹堿進行處理；?