[發明專利]多級溶劑萃取法在酶促合成異槲皮苷中的應用

有效

• 申請號: 201310616151.5
• 申請日: 2013-11-28
• 公開（公告）號: CN103613623A
• 公開（公告）日: 2014-03-05
• 發明（設計）人: 王俊;吳福安;孫國霞;龐娜;顧雙雙
• 申請（專利權）人: 江蘇科技大學
• 主分類號: C07H17/07
• 分類號: C07H17/07;C07H1/06
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 樓高潮

技術領域

本發明涉及一種生物化工分離方法，具體涉及一種利用高效萃取體系從蘆丁的酶促選擇性水解液中制備異槲皮苷的方法。

背景技術

異槲皮苷屬黃酮類化合物，是槲皮素與葡萄糖形成的糖苷，故又稱為槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷；它又是蘆丁的衍生物，在結構上比蘆丁少一個鼠李糖。國內外研究表明，異槲皮苷具有抗氧化、抗炎、抗抑郁、降壓、降脂、降酶、抗誘變、抗病毒等多種藥理作用，且在制備治療心肌缺氧、腦缺氧、缺血性疾病以及抗血栓藥物中作為有效成分而備受重視(J.Food.Sci,2008,73(7):561-568)。除此之外，異槲皮苷還能夠抑制血管緊張素轉化酶，起到抗高血壓的功效；具有抗黑色素生成的生理功能(Inflammation?Res,2007,56(10):402-408;J.EthnopHarmacol,2011,134(2):363-372)。針對異槲皮苷的藥理作用，常被用作輔助藥物或藥物有效成分，其相關制劑開發前景廣闊，有望成為新型高效的小分子臨床藥物。近年來，以異槲皮苷為原料合成的EMIQ（Enzymatically?modified?isoquercitrin）是一種新型的多用途食品添加劑，具有優質的抗氧化和著色特性，其安全性已獲美國食品藥品監督管理局的認證（中國生物工程雜志,2013,33(3)：130-134）。

異槲皮苷在自然界植物中的分布較廣（如桑葉、田基黃、羅布麻等），但含量卻極低，提取法制備異槲皮苷的難度極大，成本高，從而阻礙了其實際應用。研究發現，在分子結構上比異槲皮苷多一個鼠李糖基的蘆丁在自然界分布廣泛、來源豐富，以其為原料經橙皮苷酶（含鼠李糖苷酶）催化水解可選擇性制備異槲皮苷。然而，在緩沖溶液體系中底物蘆丁的溶解性較差，導致橙皮苷酶的催化效率較低。之后，在緩沖體系中添加一定比例的[Bmim][BF₄]形成共溶劑體系，有效地提高了蘆丁的溶解度（從0.08g/L提高到0.80g/L），提高了糖苷酶的催化效率（摩爾得率可達91.41%），表明離子液體的共溶劑效應可以有效地強化選擇性酶促合成異槲皮苷，操作簡便，且對環境友好。在此基礎上，如何從蘆丁酶促水解液中低成本地分離出高純度的異槲皮苷是其實際應用的根本保證。因為高效的分離純化方法可以提高異槲皮苷的實際產量及質量，從而降低異槲皮苷的生產成本。因此，迫切需要開發一種生產成本低、工藝收率高、產品純度好的高效萃取體系制備異槲皮苷的新方法。

對于異槲皮苷的分離純化技術迄今報道較少，如使用聚酞胺樹脂層析法（光譜實驗室,2013,30(1):257-261）和硅膠板層析法（大連工業大學學報,2012,31(6):399-401），但這些實驗室方法制備能力低，且成本高。到目前為止，尚未有利用溶劑多級萃取蘆丁酶解液中異槲皮苷的工藝報道。本專利利用溶劑多級萃取蘆丁酶解液中異槲皮苷，為生物轉化天然產物的后期產物分離提供了新的思路和方法。

發明內容

解決的技術問題：本發明針對以上技術問題，提供一種利用溶劑多級萃取蘆丁酶解液中異槲皮苷的方法。該方法能夠實現蘆丁水解反應后產物異槲皮苷更高效地分離純化，低成本獲得高純度產物。

技術方案：多級溶劑萃取法在酶促合成異槲皮苷中的應用，萃取過程為：將蘆丁溶解在pH為9.0的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液溶液中，濃度為1g/L，再分別加入溶液體積10%的離子液體[Bmim][BF₄]和18%的濃度為0.01g/mL的橙皮苷酶液構成反應體系，在40℃下恒溫振蕩培養得到蘆丁水解液，離子液體共溶劑體系蘆丁水解液的pH在2.0～7.0之間；蘆丁水解液與萃取劑混合，水浴恒溫4～35℃震蕩后，進行溶劑萃取，有機相與水相的相比在0.2～2.0之間，時間為10～150min，之后采用多級逆流萃取公式計算理論級數，在達到完全萃取時，根據所需最少比例的萃取劑及理論級數來篩選出最佳萃取條件，多級逆流萃取理論級數N的計算公式可表示為：