[發明專利]一種循環腫瘤細胞的富集方法

在審

• 申請號: 201310614556.5
• 申請日: 2013-11-28
• 公開（公告）號: CN103630440A
• 公開（公告）日: 2014-03-12
• 發明（設計）人: 龐代文;溫聰穎;吳玲玲;張志凌
• 申請（專利權）人: 武漢大學
• 主分類號: G01N1/40
• 分類號: G01N1/40
• 代理公司: 武漢科皓知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 42222
• 代理人: 汪俊鋒

技術領域

本發明涉及一種循環腫瘤細胞的富集方法，屬于納米材料技術領域。

背景技術

癌癥是當今世界人類健康和生命的最大威脅，以至于人人“談癌色變”。而上皮來源的惡性腫瘤是最常見的一種癌癥，乳腺癌、肺癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、食道癌等都屬于這類癌癥，這類癌癥帶來的死亡主要是由于癌癥的復發和轉移造成的。近年來的研究表明，癌細胞可以從原發腫瘤組織脫落進入血液系統，成為循環腫瘤細胞(CTCs)，是癌癥轉移的重要中間事件，CTCs的數目與癌癥病人的生存率關系極大，因此檢測CTCs在醫學上具有重要的意義。但是CTCs以極低濃度存在于血液中，所以檢測CTCs面臨的最大的困難就是濃度低環境復雜。

隨著科學技術的發展，人們建立了很多種檢測CTCs的方法。由于CTCs濃度低，所以一般要先對CTCs進行有效的分離和純化。其中，磁富集是應用最為廣泛的一種分離技術，其操作容易，捕獲效率高，應用前景好。但目前大多用微米級磁球捕獲CTCs，捕獲腫瘤細胞后需要經過磁球釋放過程才能進行分析，這無疑使CTCs的檢測和分析變得比較繁瑣。只有Veridex公司開發的CellSearch系統以及MiltenyiBiotec公司開發的MACS系統是使用納米級磁球捕獲腫瘤細胞。CellSearch系統使用的是120-200?nm磁性納米球，其在捕獲細胞過程中增加了額外的步驟來增強納米球的磁性：首先在磁性納米球上偶聯上抗上皮細胞粘附分子抗體和生物素類似物，用這種免疫磁球去捕獲CTCs；然后加入鏈酶親和素與生物素類似物結合；再加入過量的磁球與SA結合，這樣增大了磁球的體積，使磁響應變快從而使磁分選容易進行；經過分離和洗滌等步驟后，加入生物素，由于其與鏈酶親和素的結合能力強于生物素類似物，可以把鏈酶親和素競爭的結合下來，從而釋放多余的磁球。這種方法為CTCs的捕獲引入了很多步驟，操作比較繁瑣。而MACS系統使用的是50?nm的磁性納米球，磁響應較慢，需要強磁性的磁分離工具——磁分離柱(MACS?Columns和MACS?Separator)才能完成分選，這不方便普通用戶。所以開發一種磁響應迅速，用普通磁鐵就可以完成磁分選，且處于納米尺寸，用其捕獲CTCs后不用經過磁球釋放可直接用于后續分析和檢測的磁球，將為CTCs的研究提供更有力的手段。

發明內容

本發明所要解決的問題在于制備一種處于納米尺寸且響應迅速的磁球并提供一種快速、高效捕獲循環腫瘤細胞(CTCs)的方法及其試劑盒，為CTCs的檢測、分析、研究提供有力的手段。

具體的技術方案是：

利用層層組裝法制備380?nm磁性納米球，并將抗上皮細胞粘附分子抗體共價偶聯到磁性納米球表面，制備得到免疫磁球；

將免疫磁球加入到待檢樣品中，37°C孵育5?min，磁分選并用1×PBS緩沖溶液洗滌，即實現了對循環腫瘤細胞的分離和富集。

所述免疫磁球是按照下面方法制備的：首先以苯乙烯-丙烯酰胺共聚納米球為模板，在其表面層層組裝油溶性的磁性納米粒子nano-γ-Fe₂O₃，組裝五層后，再在其表面包被SiO₂，之后經過丁二酸酐化在納米球表面引入羧基，再通過1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)/N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)活化磁球表面的羧基，然后與抗體上的氨基共價偶聯。

免疫磁球粒徑約為380?nm，處于納米尺寸，飽和磁化強度大于30?emu/g，磁響應迅速，置于磁力架上吸附1?min，絕大部分磁球即可被捕獲。

所述待檢樣品為患有上皮組織來源惡性腫瘤的病人的外周血樣品。

本發明方法捕獲的細胞，無需進行磁球釋放，即可以采用免疫細胞化學進行鑒定，也可以直接用于培養、逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)。