[發明專利]一種重組表達甘露聚糖酶的工程菌株

有效

• 申請號: 201310612979.3
• 申請日: 2013-11-27
• 公開（公告）號: CN103725621A
• 公開（公告）日: 2014-04-16
• 發明（設計）人: 李佩佩;康麗華;王華明;黃亦鈞
• 申請（專利權）人: 青島蔚藍生物集團有限公司
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N9/42;A23K1/165;C12R1/84
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于微生物工程技術領域，具體涉及一種重組表達甘露聚糖酶的工程菌株及其應用。

背景技術

甘露聚糖酶是一種半纖維素水解酶，以內切方式降解β-1，4糖苷鍵，降解產物的非還原末端為甘露糖，其作用底物包括葡萄甘露聚糖、半乳甘露聚糖及β-甘露聚糖等。它不僅能夠降低腸道粘度，促進營養物質的消化和吸收，而且還可消除豆類中富含的β-甘露聚糖對葡萄糖吸收的干擾，極大提高餅粕尤其是豆粕的能量消化率；同時，添加了甘露聚糖酶后動物的抵抗力及整齊度都有所提高。

甘露聚糖類物質作為半纖維素的第二大組分，廣泛分布于自然界中。它是所有豆科植物細胞壁的主要組成成分，在其它植物性飼料原料中含量也很高，如豆粕、小麥、菜籽粕、麩皮中半乳甘露聚糖占非淀粉多糖含量分別為22.7％、11.9％、19.6％和33.7％。

我國豬、雞的主要日糧是玉米-豆粕型日糧，盡管豬、雞等單胃動物對玉米的消化率較高，但對豆粕的能量利用率僅為50％～60％。單胃動物對豆粕能量的利用率如此低的原因可能是豆粕中含有的22.7％的半纖維素是不能被單胃動物消化的非淀粉多糖。飼料中添加甘露聚糖酶可以降解甘露聚糖，降低消化道內容物粘度，破壞植物性飼料細胞壁結構，使營養物質能與消化酶充分接觸，提高內源酶的活性，改善腸道微生物菌群和提高腸粘膜的完整性等功能。因此，目前對甘露聚糖酶的研究是熱點內容。

發明內容

本發明的目的是提供一種甘露聚糖酶的重組表達菌株，本發明通過將來源于枯草芽孢桿菌（Bacillus?subtilis）的甘露聚糖酶基因轉化入畢赤酵母中，構建得到了高效重組表達甘露聚糖酶的工程菌株，從而彌補現有技術的不足。

本發明一方面提供了一種畢赤酵母工程菌，其攜帶有能表達甘露聚糖酶的重組質粒。

所述重組質粒含有枯草芽孢桿菌的甘露聚糖酶基因。

所述基因的核苷酸序列為SEQ?ID?NO:?2，其編碼的氨基酸序列為SEQ?ID?NO:?1。

本發明的另一方面涉及上述甘露聚糖酶在飼料中的應用。

本發明通過將枯草芽孢桿菌的甘露聚糖酶基因導入畢赤酵母中，構建了重組表達該基因的畢赤酵母工程菌。所述畢赤酵母工程菌能高效表達甘露聚糖酶，搖瓶發酵酶活達912U/mL。重組甘露聚糖酶的最適作用pH為4，最適作用溫度為58℃。通過在日糧中添加本發明的甘露聚糖酶，實驗組肉雞日增重、育肥指數比正對照組分別高2%、2.6%，料肉比比正對照組降低了5.6%，說明本發明的甘露聚糖酶能顯著提高飼料的利用率，提高肉雞的日增重和育肥指數，降低料重比，從而可以減少畜禽養殖中飼料的使用量，節約糧食資源和養殖成本，增加生產效益。

具體實施方式

下面結合實例對本發明的方法做進一步說明，實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常可按常規條件，如J.薩姆布魯克（Sambrook）等編寫的《分子克隆實驗指南》中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件運行。本領域相關的技術人員可以借助實施例更好地理解和掌握本發明。但是，本發明的保護和權利要求范圍不限于所提供的案例。

實施例1??甘露聚糖酶基因的克隆

挑取新鮮的枯草芽孢桿菌CGMCC1.897（購自中國普通微生物菌種保藏管理中心）單菌落于5mL?LB液體培養基中，37℃搖床200rpm振蕩培養過夜，按照Tiangen?細菌基因組提取試劑盒（天根生化科技有限公司）的說明提取染色體。

根據NCBI上甘露聚糖酶同源序列設計引物，以枯草芽孢桿菌CGMCC1.897染色體為模板，利用上下游引物進行擴增，擴增條件為：?94℃預變性5min，94℃變性40s，60℃退火40s，72℃延伸60s，30個循環后，72℃延伸10min。凝膠回收試劑盒回收PCR擴增產物，將該產物命名為Man-1。

將Man-1克隆至pMD18-T載體，構建得到質粒pT-Man-1，送至北京華大基因測序中心進行測序，測得Man-1基因序列為SEQ?ID?NO:1，其編碼氨基酸序列為SEQ?ID?NO:2。將該序列進行NCBI同源序列比對，確定Man-1基因為一新的甘露聚糖酶基因，與現有公開序列相似性最高為88%。

實施例2??表達載體的構建