[發(fā)明專利]MUC1和GM-CSF雙基因共表達(dá)重組載體及其制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310611552.1
• 申請日: 2013-11-25
• 公開（公告）號: CN103602706A
• 公開（公告）日: 2014-02-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 曹毓琳;左百樂;栗炳南;連杰;林俊堂;豐慧根
• 申請（專利權(quán)）人: 河南省華隆生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/66;A61K48/00;A61P35/00
• 代理公司: 廣州華進(jìn)聯(lián)合專利商標(biāo)代理有限公司 44224
• 代理人: 潘雯瑛;秦雪梅

1.MUC1和GM-CSF雙基因共表達(dá)重組載體，其沿載體轉(zhuǎn)錄方向依次連接有MUC1基因、IRES序列和GM-CSF基因，或者沿載體轉(zhuǎn)錄方向依次連接有GM-CSF基因、IRES序列和MUC1基因；

所述MUC1基因的核苷酸序列如序列表中SEQ?ID?NO:1所示，所述GM-CSF基因的核苷酸序列如序列表中SEQ?ID?NO:2所示，所述IRES序列的核苷酸序列如序列表中SEQ?ID?NO:3所示。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的MUC1和GM-CSF雙基因共表達(dá)重組載體，其特征在于：所述的載體為pIRES2-EGFP質(zhì)粒載體，所述的雙基因共表達(dá)重組載體為pIRES2-MUC1-GM-CSF重組載體；其中，MUC1基因位于IRES序列的上游，GM-CSF基因位于IRES序列的下游。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的MUC1和GM-CSF雙基因共表達(dá)重組載體，其特征在于：所述pIRES2-EGFP質(zhì)粒載體中的EGFP序列被GM-CSF基因替代。

4.權(quán)利要求1所述的MUC1和GM-CSF雙基因共表達(dá)重組載體的制備方法，包括以下步驟：

1）獲得含有特異性酶切位點(diǎn)的MUC1基因片段；

2）將步驟1）得到的MUC1基因片段連接于載體，構(gòu)建含有MUC1基因的重組載體；

3）獲得含有酶切粘性末端的GM-CSF基因片段；

4）將步驟3）得到的GM-CSF基因片段連接于步驟2）得到的重組載體，構(gòu)建所述的MUC1和GM-CSF雙基因共表達(dá)重組載體。

5.權(quán)利要求2所述的MUC1和GM-CSF雙基因共表達(dá)重組載體的制備方法，包括以下步驟：

a）獲得含有特異性酶切位點(diǎn)的MUC1基因片段：從乳腺癌細(xì)胞MCF-7獲取cDNA作為模板，用含有Bgl?II和EcoR?I酶切位點(diǎn)序列的MUC1特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到含有Bgl?II和EcoR?I酶切位點(diǎn)的MUC1基因片段，其核苷酸序列如序列表中SEQ?ID?NO:6所示；

b）構(gòu)建pIRES2-MUC1-EGFP重組載體：用限制性內(nèi)切酶Bgl?II、EcoR?I分別酶切pIRES2-EGFP質(zhì)粒以及步驟a）得到的MUC1基因片段，并采用T4DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，得到pIRES2-MUC1-EGFP重組載體；

c）獲得含有酶切粘性末端的GM-CSF基因片段：從CIK細(xì)胞獲取cDNA作為模板，用含有BstX?I和Not?I酶切粘性末端的GM-CSF特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所得到的PCR反應(yīng)產(chǎn)物再進(jìn)行雜交PCR反應(yīng)，得到GM-CSF基因片段混合物，其中的一種GM-CSF基因片段具有BstX?I和Not?I酶切粘性末端；

d）構(gòu)建pIRES2-MUC1-GM-CSF重組載體：用限制性內(nèi)切酶BstX?I、Not?I酶切步驟b）得到的pIRES2-MUC1-EGFP重組載體，將步驟c）得到的GM-CSF基因片段混合物與酶切后線性化的pIRES2-MUC1-EGFP重組載體混合，采用T4DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，得到pIRES2-MUC1-GM-CSF重組載體。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，步驟a）所述的MUC1特異性引物為：

MUC1上游引物：5’-GAAGATCTATGACACCGGGCACCC-3’，

MUC1下游引物：5’-TTGAATTCCTACAAGTTGGCAGAAGTGG-3’。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，步驟c）所述的GM-CSF特異性引物包括GM-CSF第一引物對和GM-CSF第二引物對，所述的GM-CSF第一引物對由GM-CSF上游長引物和GM-CSF下游長引物組成，所述的GM-CSF第二引物對由GM-CSF上游短引物和GM-CSF下游短引物組成：

GM-CSF第一引物對為：

GM-CSF上游長引物：5'-AACCATGTGGCTGCAGAGCCTGCT-3'，

GM-CSF下游長引物：5'-GGCCGCTCACTCCTGGACTGGCTC-3'；

GM-CSF第二引物對為：

GM-CSF上游短引物：5'-ATGTGGCTGCAGAGCCTGCT-3'，

GM-CSF下游短引物：5'-GCTCACTCCTGGACTGGCTC-3'。