[發明專利]一種人FGF21單克隆抗體的輕鏈和重鏈可變區

有效

• 申請號: 201310609880.8
• 申請日: 2013-11-27
• 公開（公告）號: CN103601805A
• 公開（公告）日: 2014-02-26
• 發明（設計）人: 劉銘瑤;郝智超;王文飛;吳云舟;任桂萍;李德山
• 申請（專利權）人: 東北農業大學
• 主分類號: C07K16/22
• 分類號: C07K16/22;C12N15/13
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種單克隆抗體，特別涉及一種抗人FGF21的單克隆抗體輕鏈和重鏈可變區，包括其氨基酸序列和核苷酸序列，以及利用所述基因構建其他基因工程抗體的應用。?

背景技術

成纖維細胞生長因子（Fibroblast?Growth?Factor，FGF）是一類通過與細胞膜特異性受體結合發揮作用，調節細胞生長的多肽類分子。FGF21是Tetsuya?Nishimura等人于2000年在小鼠胚胎中分離獲得的FGF家族中的一個新成員。人源FGF-21基因定位于人α1，2-墨角藻糖基轉移酶基因的5’側翼區，編碼一個209個氨基酸大小的多肽，蛋白N端前有28個氨基酸構成信號肽序列，其成熟的蛋白包含181個氨基酸并可以分泌到細胞外，目前FGF-21是少數幾個可以在血清中檢測到的FGF因子之一。依據分子結構上的親緣關系以及生物學功能，FGF21與FGF19、FGF23共同組成FGF19亞家族。?

由于FGF19對內分泌代謝有一定的調節能力，而FGF21與FGF19的同源性比較高，因此研究人員推測FGF-21可能也具有相應的能力。自2005年Lilly公司的研究人員首次在細胞水平和動物水平揭示FGF-21的生物學活性以來，隨著研究不斷發展，研究者不斷發現FGF21在調節糖脂代謝上具有重要的生理學意義，如FGF21可以調節血糖、血脂、改善胰島素抵抗、降低體重、抑制早期肝癌的形成等，并且未發現FGF21在促有絲分裂、導致低血糖、體重增加等方面的副作用，由此強烈提示FGF21在治療糖尿病、肥胖、脂肪肝、心腦血管等代謝疾病上都具有巨大的潛力。?

FGF21在調節內分泌代謝上巨大作用使其成為新藥研發人員及醫藥領域的研究熱點，但FGF21在機體內的代謝網絡是一個極其復雜的系統。至今FGF21調節代謝的作用機制還沒有完整的定論，作用機制不明嚴重制約了其作為藥物的開發與應用，用此單克隆抗體一方面可以通過檢測體內FGF-21水平的變化來反應疾病的發生情況進而開發成相應的治療性藥物，另一方面利用此單克隆抗體有效阻斷FGF-21與相關受體結合，可進一步研究FGF21的作用機制，為推進FGF21的藥物開發提供有力支持。?

發明內容

本發明的目的在于提供一種高親和力的人FGF21單克隆抗體的重鏈和輕鏈可變區，包括其基因及氨基酸序列，為構建高親和力的抗人FGF21的基因工程抗體提供支持，以及將其應用于研究FGF21治療內分泌等代謝疾病藥物開發方面奠定基礎。?

本發明還具有如下技術特征：?

1、一種人FGF21?單克隆抗體，包含輕鏈可變區和重鏈可變區，輕鏈可變區氨基酸序列如序列表Seq?No.1所示，重鏈可變區氨基酸序列如序列表Seq?No.2所示；

2、一種DNA分子，編碼上述的人FGF21的單克隆抗體；

3、如上所述的一種DNA分子，編碼所述單克隆抗體的輕鏈可變區核苷酸序列如序列表Seq?NO?.3所示，以及編碼所述單克隆抗體的重鏈可變區核苷酸序列如序列表Seq?NO.4所示。

本發明通過以下技術方案來實現：?

1、獲取陽性雜交瘤細胞株：將人源FGF21蛋白免疫BALB/C小鼠，從免疫成功小鼠無菌取其脾細胞作為抗原致敏的B細胞，按常規方法，將B細胞與骨髓瘤細胞SP2/0株融合，利用HAT篩選，經3次亞克隆后獲得一株穩定分泌抗人FGF21單克隆抗體的雜交瘤細胞株；

2、采用上述雜交瘤細胞株制備單克隆抗體與純化：在動物腹腔內接種上述雜交瘤細胞，經體內誘生后收集腹水，將腹水離心去除脂類等雜質，分離獲得的單克隆抗體采用Protein?A?Sepharose純化；

3、鑒定單克隆抗體亞型：采用常規試劑盒鑒定單克隆抗體亞型；

4、上述技術方案中獲得的單克隆抗體采用間接ELISA方法測定其效價；

5、本發明雜交瘤分泌的抗體具有良好的穩定性和特異性，通過體外實驗發現，本發明獲得單克隆抗體對人FGF21具有中和活性；

6、克隆上述FGF21單克隆抗體輕、重鏈可變區基因。輕鏈可變區核苷酸序列如序列表Seq?NO?.3所示，重鏈可變區核苷酸序列如序列表Seq?NO.4所示。獲得該單克隆抗體輕鏈和重鏈可變區氨基酸序列，輕鏈可變區的氨基酸序列Seq?No.1所示，重鏈可變區氨基酸序列如Seq?No.2所示；

7、利用上述核苷酸序列可構建人源化抗體、單鏈抗體、全長抗體等其他基因工程抗體。

附圖說明

圖1是單克隆抗體純化后蛋白膠圖?