[發(fā)明專利]一種花生青枯病菌巢式PCR檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310609847.5
• 申請日: 2013-11-27
• 公開（公告）號: CN103614475A
• 公開（公告）日: 2014-03-05
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 游泳;謝世勇;李本金;陳慶河;丁雪玲;劉裴清
• 申請（專利權(quán)）人: 福建省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 福州元創(chuàng)專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種花生青枯病菌巢式PCR檢測方法。

背景技術(shù)

花生青枯病是由Ralstonia?solanacearu引起的一種細菌性維管束病害。該病害于1905年在印度尼西亞首次報道，隨后在20多個國家和地區(qū)相繼發(fā)生或出現(xiàn)報道。目前，主要以中國、印度尼西亞和越南危害較重。我國關(guān)于花生青枯病的報道始見于30年代后期，現(xiàn)在主要分布于中部和南方地區(qū)，每年全國實際病地面積在40萬hm²以上，受危害程度居世界首位。花生青枯病發(fā)病率一般在10%－30%左右，減產(chǎn)20%以上；重病區(qū)發(fā)病率可在50%以上，甚至導致完全絕收。近年來有報道顯示，花生青枯病表現(xiàn)出向北蔓延的趨勢，給花生生產(chǎn)帶來更大威脅。除引起減產(chǎn)外，青枯病的發(fā)生還會降低花生品質(zhì)，并增加黃曲霉毒素的污染。同時，花生青枯病是一種土傳病害，可經(jīng)雨水、土壤、病殘體等從發(fā)病區(qū)向未發(fā)病區(qū)傳播，且其侵染能力強，在較短的時間內(nèi)可造成植株枯萎死亡。隨著設(shè)施農(nóng)業(yè)的高度集約化生產(chǎn)，復種指數(shù)高，品種單一，導致該類病害的發(fā)生越來越嚴重。因此，開展花生青枯病菌的快速檢測，對該病害的早期診斷和及時防治具有十分重要的意義。

目前，關(guān)于花生青枯病菌的檢測方法包括傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法、血清學和分子生物學等方法。青枯病菌的傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法是采用選擇性培養(yǎng)基對病原物進行分離純化，然后進行一系列的生理生化實驗進行診斷，該方法易受外界因素的影響且靈敏度較低。而應(yīng)用血清學方法時血清的制備過程耗時耗力，且可能存在交叉反應(yīng)，造成檢測結(jié)果的假陽性。基于PCR原理的分子生物學技術(shù)是一種靈敏度高、特異性強的快速檢測技術(shù)，已在多種植物病害的檢測中得到廣泛應(yīng)用。在細菌基因組中，16S-23S?rDNA?ITS序列在物種進化過程中具有高度的保守性，目前很多病原細菌分子檢測方法的建立都是基于這一位點。本發(fā)明通過比較花生青枯病菌和同屬近緣種的16S-23S?rDNA?ITS序列選擇差異位點設(shè)計特異引物，采用巢式PCR對花生青枯病菌進行檢測，靈敏度高，特異性強，國內(nèi)外尚未見報道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種花生青枯病菌的巢式PCR檢測方法，其具有特異性強、靈敏度高的特點，可用于田間花生青枯病的早期診斷，對花生青枯病菌引起病害顯癥之前的早期監(jiān)測和及時防治具有十分重要的意義。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案來實現(xiàn)：

一種花生青枯病菌的巢式PCR檢測方法，其特征在于：包括以下步驟：

步驟1）、基因組DNA提取：采用CTAB法提取花生青枯病菌基因組DNA或發(fā)病植物組織DNA；

步驟2）、第一輪PCR擴增：以步驟1）得到的DNA樣品為模板，采用細菌16S-23S?rDNA?ITS序列通用引物L1/L2經(jīng)PCR擴增得到第一輪PCR產(chǎn)物；

引物序列：L1：5’-AGTCGTAACAACGTAGCCGT-3’（SEQ?ID?NO:1）；

??????????L2：5’-GTGCCAAGGCATCCACC-3’（SEQ?ID?NO:2）；

PCR反應(yīng)體系25μl：DNA模板?1μl，10×PCR反應(yīng)緩沖液?2.5μl，2.5?mmol/L?dNTPs混合液?2μl，5U/μl?DNA?Taq聚合酶?0.5μl，10μ?mol/L的L1引物1μl，10μ?mol/L的L2引物1μl，滅菌超純水補足至25μl；

PCR擴增程序：95℃預(yù)變性4min，94℃變性1?min，60℃退火30?sec，72℃延伸45sec，共30個循環(huán)；72℃延伸10min；4℃保存；

步驟3）、第二輪PCR擴增：以第一輪PCR擴增產(chǎn)物或擴增產(chǎn)物的稀釋液為模板，采用花生青枯病菌特異引物W1/W2經(jīng)PCR擴增得到第二輪PCR擴增產(chǎn)物；

引物序列：W1：5’-TCCTACCAGACCCACCAAG?TTACGG-3’（SEQ?ID?NO:3）；

??????????W2：5’-GTATGTCTCGCTATAGGCTGAGTTC-3’（SEQ?ID?NO:4）；

PCR反應(yīng)體系25μl：第一輪PCR擴增產(chǎn)物或擴增產(chǎn)物的稀釋液?1μl，10×PCR反應(yīng)緩沖液?2.5μl，2.5?mmol/L?dNTPs混合液2μl，5U/μl?DNA?Taq聚合酶0.5μl，10μ?mol/L的W1引物1μl，10μ?mol/L的W2引物1μl，滅菌超純水補足至25μl；