[發(fā)明專(zhuān)利]利用多肽介導(dǎo)的DNA納米結(jié)構(gòu)用作抗腫瘤藥物載體的方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310607898.4
• 申請(qǐng)日: 2013-11-27
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103656662A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-03-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 顏娟;宋世平;樊春海;金彩虹;何丹農(nóng)
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 上海納米技術(shù)及應(yīng)用國(guó)家工程研究中心有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): A61K47/42
• 分類(lèi)號(hào): A61K47/42;A61K47/26;A61P35/00
• 代理公司: 上海東方易知識(shí)產(chǎn)權(quán)事務(wù)所 31121
• 代理人: 唐莉莎

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于納米材料功能化及應(yīng)用領(lǐng)域，涉及一種通過(guò)多肽介導(dǎo)，DNA納米結(jié)構(gòu)可將負(fù)載的生物分子高效載入細(xì)胞的技術(shù)；構(gòu)建的生物復(fù)合結(jié)構(gòu)可用于新型高效抗腫瘤藥物載體的開(kāi)發(fā)及研究。

背景技術(shù)

癌癥已經(jīng)超越心腦血管疾病，成為危害人類(lèi)生命的頭號(hào)敵人。隨著腫瘤發(fā)病率的日趨升高，人們對(duì)癌癥診斷和治療的研究也在不斷加深。目前已經(jīng)形成一些共識(shí)，包括：對(duì)于多種惡性腫瘤組織和細(xì)胞，準(zhǔn)確可靠的早期診斷比較困難；當(dāng)前的抗癌藥物因生物相容性問(wèn)題存在嚴(yán)重的毒副作用；體內(nèi)多變環(huán)境也限制了抗癌藥物的應(yīng)用等。因此，如何實(shí)現(xiàn)診斷探針及治療藥物特異性地進(jìn)入癌細(xì)胞，并且能實(shí)現(xiàn)低毒和高效的診治是亟待解決的生命科學(xué)問(wèn)題。新型的納米材料以及結(jié)構(gòu)的制備與應(yīng)用不僅給納米技術(shù)注入了新的活力，也給抗腫瘤藥物的研究及發(fā)展起了巨大的推動(dòng)作用。目前利用納米顆粒或納米結(jié)構(gòu)作為抗腫瘤藥物載體進(jìn)行抗腫瘤的研究中，使用較多的如高分子納米材料、脂質(zhì)體以及金屬納米粒子等，并且已有很多納米藥物運(yùn)載系統(tǒng)成功應(yīng)用的先例，但不可否認(rèn)的是，在藥物的高效負(fù)載、靶向輸運(yùn)、集治療和檢測(cè)于一體的多功能藥物載體的研究里關(guān)于仍然存在諸多問(wèn)題，比如脂質(zhì)體的粒徑分布可能影響載體進(jìn)入細(xì)胞的效率，另外一些金屬納米粒子存在生物安全方面的爭(zhēng)議等。因此，近幾年國(guó)際上基于DNA分子進(jìn)行設(shè)計(jì)的納米生物復(fù)合結(jié)構(gòu)，成為新一代的抗腫瘤藥物載體的相關(guān)研究備受矚目。在充分利用和發(fā)展納米技術(shù)特有的優(yōu)勢(shì)的基礎(chǔ)上，有望基于DNA納米結(jié)構(gòu)制備高效、靶向、低毒及多功能的納米生物復(fù)合結(jié)構(gòu)作為抗腫瘤藥物載體從而促使藥物發(fā)揮更為高效作用，為抗腫瘤研究工作累計(jì)理論基礎(chǔ)和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。但同時(shí)也不可忽略的是，目前所制備的DNA納米結(jié)構(gòu)尺寸較大，較難直接作為抗腫瘤藥物載體運(yùn)載藥物分子進(jìn)入細(xì)胞，因此，本發(fā)明通過(guò)多肽介導(dǎo)，可實(shí)現(xiàn)DNA納米結(jié)構(gòu)可將負(fù)載的生物分子高效載入細(xì)胞。

發(fā)明內(nèi)容

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種多肽介導(dǎo)的DNA納米結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)生物分子高效載入細(xì)胞的新方法，可將生物分子負(fù)載于DNA納米結(jié)構(gòu)上，在多肽的介導(dǎo)下，可以特異性地與細(xì)胞表面受體作用；或在穿膜肽的作用下，將藥物分子載入腫瘤細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)治療的目的。在抗腫瘤藥物載體的開(kāi)發(fā)、研究及提高抗腫瘤藥物載體的載入效率等方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

一種利用多肽介導(dǎo)的DNA納米結(jié)構(gòu)用作抗腫瘤藥物載體的方法，其特征在于，將具備一定功能的多肽連接在DNA納米結(jié)構(gòu)上，所制備的產(chǎn)物為DNA納米結(jié)構(gòu)與多肽的復(fù)合物，DNA納米結(jié)構(gòu)表面負(fù)載生物分子后與細(xì)胞相互作用時(shí)，特定功能的多肽能介導(dǎo)負(fù)載生物分子的DNA納米結(jié)構(gòu)進(jìn)入細(xì)胞或特異性地與細(xì)胞表面的受體結(jié)合，實(shí)現(xiàn)DNA結(jié)構(gòu)用作抗腫瘤藥物載體的目的；

其中所述的DNA納米結(jié)構(gòu)，由DNA通過(guò)自組裝、延伸、折疊等技術(shù)構(gòu)成的一類(lèi)納米結(jié)構(gòu)，組成此結(jié)構(gòu)的單鏈DNA，可經(jīng)過(guò)如巰基、生物素、或氨基等修飾。

多肽介導(dǎo)的DNA納米結(jié)構(gòu)的制備包括以下幾個(gè)步驟：

（1）長(zhǎng)鏈DNA溶液中中，加入訂書(shū)釘鏈DNA，高溫下混合均勻后緩慢降至室溫；

（2）向（1）步驟所得產(chǎn)物中，加入生物分子，混合均勻后水浴中連接；

（3）向（2）步驟所得產(chǎn)物中，加入多肽溶液，混合均勻后水浴中連接；

（4）將（3）步驟所得的產(chǎn)物加入到到細(xì)胞培養(yǎng)皿中，37℃，5.0%二氧化碳的細(xì)胞培養(yǎng)箱中與細(xì)胞共培養(yǎng)；

（5）細(xì)胞用緩沖液洗滌后，將細(xì)胞用多聚甲醛或甲醛固定；

（6）細(xì)胞用緩沖液洗滌后，用熒光染料將細(xì)胞核染色；

（7）激光共聚焦熒光顯微鏡觀(guān)察內(nèi)部具有量子點(diǎn)熒光的細(xì)胞。

步驟（1）所述長(zhǎng)鏈DNA為合成的長(zhǎng)鏈DNA、噬菌體M13、經(jīng)過(guò)滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)所得的長(zhǎng)單鏈DNA中的一種；所述訂書(shū)釘鏈DNA，為多條能與長(zhǎng)鏈DNA互補(bǔ)雜交的單鏈DNA，可經(jīng)過(guò)巰基、氨基、生物素修飾。

步驟（1）所述高溫為95℃，室溫25℃，降溫時(shí)間為12小時(shí)以上。

步驟（2）所述生物分子為親和素、鏈霉親和素、量子點(diǎn)、熒光分子、納米粒子、DNA、RNA、多肽、小分子藥物中的一種；其中量子點(diǎn)發(fā)射波長(zhǎng)為560、580、600、620、640nm。?

步驟（2）所述生物分子連接條件為37℃水浴，30分鐘以上。

步驟（3）所述多肽是由氨基酸構(gòu)成的功能性蛋白質(zhì)，具體為穿膜肽、與細(xì)胞表面受體結(jié)合的功能性多肽。

步驟（3）所述與多肽連接條件為室溫30分鐘以上。

步驟（3）所述多肽通過(guò)靜電吸附作用方式連接在DNA納米結(jié)構(gòu)上。