[發明專利]玉米營養器官特異性啟動子及其應用

有效

• 申請號: 201310607845.2
• 申請日: 2013-11-25
• 公開（公告）號: CN103667290A
• 公開（公告）日: 2014-03-26
• 發明（設計）人: 程備久;董慶;項艷;江海洋;朱蘇文;李曉明;徐倩倩;楊建平
• 申請（專利權）人: 安徽農業大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/82
• 代理公司: 江蘇銀創律師事務所 32242
• 代理人: 何震花

技術領域

本發明涉及植物啟動子分離鑒定與應用。本發明克隆133bp啟動子序列能啟動下游編碼基因在水稻營養器官中表達，生殖器官中不表達。

背景技術

啟動子是重要的順式作用元件，調控基因的轉錄和表達，根據啟動子的轉錄模式不同將其分為組成型、誘導型和組織特異性啟動子三類。選擇何種啟動子來驅動基因的表達，是當前基因工程研究的熱點。?????????????????????????????

器官特異性啟動子是啟動子類型之一，能驅使外源基因在植物特有部位高效表達，減少能源浪費和對植物產生的不利影響，且能克服對基因轉化植株重復使用同一啟動子而導致的基因沉默現象，從而可以根據需要選擇特定部位或特定空間表達的啟動子調節基因轉錄與表達。從本質上說，這是由于受到各種組織細胞生理狀態，發育階段及其某種物理化學信號誘導等多種因素相互作用引起的結果。該類型啟動子除了具備啟動子一般結構特征外，還含有特殊的組織特異性序列、增強子、沉默區以及富含AT序列等。

已經從植物中分離得到了不同類型的器官組織特異性啟動子，包括花粉、維管束、根、葉、莖、種子或果實、薄壁組織，分生組織，氣孔等。Azria等（2011）從水稻中分離到了一種Orys1花粉特異性表達啟動子；Kovalchuk等（2012）從小麥中獲得了TaPR61種子特異性啟動子，該基因是一個能編碼含有疏水信號肽的脂轉運蛋白基因，其啟動子只在種子中表達；Cai等（2007）分離克隆了一個水稻來源的綠色組織特異性啟動子PD540，他們將其與cry1AC基因相融合，得到的轉基因水稻，有很好的抗蟲性，而且在種子中檢測不到蛋白的表達；劉昱輝等(2001)克隆到?在-1677~1380bp這段序列能驅動基因在維管束中特異性表達。

玉米作為重要的糧食、油料及其飼料作物，對其基因工程的研究具有重要的意義。目前很少有報道玉米中，在營養器官（根、莖、葉）部位表達，而生殖器官（花、種子）不表達的啟動子，將該基因與GUS報告基因融合，轉化到水稻中，?驗證該段啟動子的功能，該啟動子為基因工程研究中獲得抗蟲抗病及營養高效型新品種的研發創造條件，具有重要的生產價值。

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發明內容

本發明的目的是提供一種玉米營養器官特異性表達啟動子及其表達載體，以及啟動子和表達載體的用途。本發明所提供的玉米營養器官特異性表達啟動子為PZmGL6，其來源于玉米屬玉米（Zea?mays?L.）B73自交系，該啟動子片段大小為133bp，能在轉基因水稻的營養器官中特異性表達，在生殖器官等其他器官中不表達。

本發明所涉及的設計方案為一種玉米營養器官特異性表達啟動子，具有序列表中SED?ID?NO:1項下的序列。PZmGL6啟動子通過提取玉米B73自交系的總DNA克隆獲得，經過測序其為133bp。

本發明還提供了一種營養器官特異性表達的載體，其特征在于轉入了前述的營養器官特異性表達的啟動子，并在水稻中進行驗證。利用前述的玉米營養器官特異性表達啟動子取代植物表達載體pCAMBIA1301上的CaMV35S啟動子，構建成為一個新的植物表達載體，命名為pCAM–PZmGL6。通過農桿菌介導法轉化水稻，獲得了六組獨立轉化事件，共53株轉基因植株，PCR檢測有36株陽性株。并對陽性植株的T₀和T₁代的不同組織部位都進行了GUS組織化學染色。GUS組織化學染色鑒定證實PZmGL6啟動子為營養器官特異性表達啟動子，pCAM–PZmGL6為一種營養器官特異性表達的載體。

因此，在一個實施方案中，本發明提供了一種玉米營養器官特異性啟動子，其特征在于其核苷酸序列如序列表中SEQ?ID?NO:1所示。

在另一個實施方案中，本發明提供了所述啟動子用于在植物營養器官中特異性表達目的基因的用途。

在其他實施方案中，本發明提供了包含所述玉米營養器官特異性啟動子的植物表達載體。在一個實施方案中，所述載體是用所述玉米營養器官特異性啟動子取代植物雙元表達載體pCAMBIA1301上的CaMV35S啟動子，從而構建得到的植物表達載體。在另一實施方案中，所述植物表達載體能調控目的基因在植物營養器官中特異性表達。

在其他實施方案中，本發明還提供了所述啟動子用于構建在植物營養器官中特異性表達目的基因的植物表達載體的用途。