[發明專利]酸土脂環酸芽孢桿菌PCR檢測用引物、探針及應用

有效

• 申請號: 201310603130.X
• 申請日: 2013-11-21
• 公開（公告）號: CN103614470A
• 公開（公告）日: 2014-03-05
• 發明（設計）人: 岳田利;王周利;袁亞宏;蔡瑞;牛晨
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/01
• 代理公司: 西安恒泰知識產權代理事務所 61216
• 代理人: 史玫

技術領域

本發明屬于食品微生物檢測技術領域，具體涉及酸土脂環酸芽孢桿菌（A.acidoterrestris）的熒光定量PCR檢測中引物和探針及應用。

背景技術

脂環酸芽孢桿菌（Alicyclobacillus?spp.）是一種革蘭氏陽性芽孢桿菌，桿狀、產芽孢、嚴格需氧，可以在pH2.5～6.0，溫度20～60℃范圍內存活和生長。由于其具有耐熱、耐酸的特性，普通的巴氏殺菌難以將其殺滅，且其生長代謝產生愈創木酚和2,6-二溴苯酚等物質，使果汁口感、風味變差，形成白色沉淀或霧狀渾濁，因此，脂環酸芽孢桿菌成為果汁和飲料加工業中重要的質量指標。因為酸土脂環酸芽孢桿菌（A.acidoterrestris）是果汁污染和腐敗中分離最多的脂環酸芽孢桿菌類細菌，所以，A.acidoterrestris已成為果汁飲料加工生產中最重要的監測指標之一。

目前，主要采用培養法進行A.acidoterrestris的常規檢測，雖然這種方法簡單、易操作，但耗時長、檢測滯后于生產。同時，A.acidoterrestris在飲料及食品中含量非常低，復雜的食品成分和非目標微生物對目標菌體的檢測有非常大的影響，常規PCR、酶聯免疫吸附測定法、傅里葉變換紅外光譜和電子鼻等檢測方法需要與菌體培養富集結合才能到達檢測目的，因此，尚未應用于食品工業實際檢測中。

發明內容

本發明的目的是提供用于A.acidoterrestris實時熒光PCR檢測的引物及探針序列。

本發明通過對Alicyclobacillus?spp.中A.acidocaldarius,A.acidiphilus,A.contaminans,A.fastidiosus,A.herbarius,A.hesperidum,A.sendaiensis和A.acidoterrestris10個不同種細菌的16S?rDNA序列分析，分別設計了引物和熒光探針。所述的引物由上游引物和下游引物組成，其核苷酸序列如序列表中SEQ?ID?NO.1和SEQ?ID?NO.2所示；所述探針的核苷酸序列如序列表中的SEQ?ID?NO.3所示，該探針的一端標記有報告熒光染料，另一端標記有淬滅熒光染料。該探針選擇的報告熒光染料為FAM，選擇的淬滅熒光染料為MGB。

本發明還提供了一種檢測A.acidoterrestris的方法，該方法以樣品總DNA為模板，利用核苷酸序列為SEQ?ID?NO.1的上游引物和核苷酸序列為SEQ?IDNO.2的下游引物以及核苷酸序列為SEQ?ID?NO.3的探針進行實時熒光定量PCR檢測，每個循環結束后采集數據，反應結束后根據擴增曲線判定A.acidoterrestris的存在。

優選的，上述方法中的熒光定量PCR反應過程中的退火溫度為60℃。

具體的，本發明中對于A.acidoterrestris的檢測是以樣品總DNA為模板，進行實時熒光PCR反應，反應條件是在反應體系中加入無菌超純水、2×PremixEx?Taq、上游引物、下游引物、探針和總DNA。

更具體的，本發明中對于A.acidoterrestris的檢測，是在25μL反應體系中進行，反應條件是加入12.5μL2×Premix?Ex?Taq,0.5μL10μM上游引物,0.5μL10μM下游引物,1.0μL10μM探針,2.0μL總模板和8.5μL無菌超純水。

其中，熒光PCR反應的反應條件為：第一個循環為95℃10min；隨后40個循環，95℃15s，60℃1min。

本發明還提供了一種用于A.acidoterrestris檢測的試劑盒，該試劑盒含有上述上游引物SEQ?ID?NO.1、下游引物SEQ?ID?NO.2和探針SEQ?ID?NO.3。

進一步，將本發明中設計的引物、熒光探針以及相關的試劑組裝成試劑盒，以方便使用。

本發明對Alicyclobacillus?spp.中10個不同種的16S?rDNA基因序列進行比較，并設計了基于A.acidoterrestris保守區域的引物和熒光探針。通過軟件評價和對實際菌株的檢測，說明獲得的引物和探針具有非常好的特異性。本發明建立的實時熒光PCR檢測方法靈敏度高、特異性強，可以簡單快速的判斷樣品中是否含有A.acidoterrestris，具有非常廣闊的應用前景。

附圖說明