[發明專利]一種新的產N-乙酰神經氨酸大腸桿菌工程菌及其構建方法和應用

有效

• 申請號: 201310600843.0
• 申請日: 2013-11-25
• 公開（公告）號: CN103602627A
• 公開（公告）日: 2014-02-26
• 發明（設計）人: 柳鵬福;孫立潔;王紀;袁麗霞;劉洋;吳金勇;陳祥松;史吉平;姚建銘
• 申請（專利權）人: 武漢中科光谷綠色生物技術有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12P19/26;C12R1/19
• 代理公司: 武漢開元知識產權代理有限公司 42104
• 代理人: 唐正玉

1.一種產N-乙酰神經氨酸大腸桿菌工程菌，其特征在于所述工程菌是通過將6-磷酸葡萄糖胺乙酰化酶基因、N-乙酰葡萄糖胺-2-異構酶基因、N-乙酰神經氨酸合成酶基因和6-磷酸葡萄糖胺脫氨酶基因導入大腸桿菌表達構建而成的重組大腸桿菌。

2.根據權利要求1所述的大腸桿菌工程菌，其特征在于所述大腸桿菌還敲除了N-乙酰神經氨酸分解利用代謝途徑酶的基因。

3.根據權利要求2所述的大腸桿菌工程菌，其特征在于所述N-乙酰神經氨酸分解利用代謝途徑酶的基因包括編碼6-磷酸-N-乙酰葡萄糖胺脫乙酰酶的基因nagA、編碼N-乙酰神經氨酸醛縮酶的基因nanA、編碼N-乙酰神經氨酸轉運蛋白的基因nanT、編碼N-乙酰-6-磷酸甘露糖胺異構酶的基因nanE和編碼N-乙酰甘露糖胺激酶的基因nanK，其中前述后四個基因連在一起，構成一個基因簇nanATEK。

4.根據權利要求1至3任一項權利要求所述的大腸桿菌工程菌，其特征在于所述6-磷酸葡萄糖胺乙酰化酶基因、N-乙酰葡萄糖胺-2-異構酶基因、N-乙酰神經氨酸合成酶基因和6-磷酸葡萄糖胺脫氨酶基因導入大腸桿菌并高表達，是將這四個基因克隆到質粒表達載體上后，以質粒的方式在大腸桿菌中表達。

5.根據權利要求1至3任一項權利要求所述的大腸桿菌工程菌，其特征在于所述6-磷酸葡萄糖胺乙酰化酶基因來源于釀酒酵母(Saccharomyces?cerevisiae)或能表達相同功能酶的微生物。

6.根據權利要求1至3任一項權利要求所述的大腸桿菌工程菌，其特征在于所述N-乙酰葡萄糖胺-2-異構酶基因來源于魚腥藻(Anabaena)或能表達相同功能酶的微生物。

7.根據權利要求1至3任一項權利要求所述的大腸桿菌工程菌，其特征在于所述N-乙酰神經氨酸合成酶基因來源于空腸彎曲菌（Campylobacter?jejuni）或能表達相同功能酶的微生物。

8.根據權利要求1至3任一項權利要求所述的大腸桿菌工程菌，其特征在于所述6-磷酸葡萄糖胺脫氨酶基因來源于大腸桿菌（Escherichia?coli）或能表達相同功能酶的微生物。

9.利用權利要求1-8任一項所述的產N-乙酰神經氨酸大腸桿菌工程菌生產N-乙酰神經氨酸的方法，其包括如下步驟：

1）在種子培養基中多級放大培養N-乙酰神經氨酸大腸桿菌工程菌單菌落；

2）將培養好的種子接種于含有發酵培養基的發酵罐中進行發酵培養；

3）培養至菌體濃度OD₆₀₀為20～40時，加入終濃度為0.05～1mM異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，繼續培養至結束發酵。

10.根據權利要求9的生產N-乙酰神經氨酸的方法，其特征在于利用葡萄糖或甘油作為碳源進行發酵。