[發明專利]單核淋巴細胞體內示蹤方法

有效

• 申請號: 201310597958.9
• 申請日: 2013-11-22
• 公開（公告）號: CN103630679A
• 公開（公告）日: 2014-03-12
• 發明（設計）人: 潘明新;程佩倫;蔣澤生;汪艷;高毅
• 申請（專利權）人: 南方醫科大學珠江醫院
• 主分類號: G01N33/533
• 分類號: G01N33/533
• 代理公司: 北京市立方律師事務所 11330
• 代理人: 劉延喜;王增鑫

1.一種單核淋巴細胞體內示蹤方法，其特征在于，包括以下步驟：

采集食蟹猴腋窩處的淋巴結；

利用密度梯度離心法獲取所述淋巴結中的單核淋巴細胞；

將所述單核淋巴細胞進行熒光染色；

將所述染色后的單核淋巴細胞輸注至所述食蟹猴掌側大魚際下方的結締組織中；

再次采集與所述輸注位置同側的食蟹猴腋窩處的淋巴結，并對再次采集的淋巴結采用流式細胞儀進行檢測。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述熒光染色中采用的染料為羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯（CFSE）。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述采集食蟹猴腋窩處的淋巴結的步驟包括：

麻醉食蟹猴：使用氯胺酮15mg/kg進行麻醉；麻醉后將食蟹猴仰臥保定，將其腋窩局部、四肢局部剃毛以暴露手術部位和靜脈，所述靜脈用于麻醉保定后補液，補液為5％葡萄糖氯化鈉，所述補液注射速度為1mL/min；

采集淋巴結：以碘伏消毒所述手術部位，醫用酒精脫碘；從食蟹猴腋中線剪開一小口，分離淺筋膜，暴露其深層的結締組織、脂肪組織及淋巴結，取出淋巴結。

4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述利用密度梯度離心法獲取所述淋巴結中的單核淋巴細胞的步驟包括：

200目不銹鋼網研磨所述淋巴結，并利用磷酸鹽緩沖液、Hank′s液或RPMI1640制備淋巴細胞懸液；

在所述懸液中加入紅細胞裂解液以裂解懸液中的紅細胞；

將所述紅細胞裂解后的懸液緩慢加入葡聚糖-泛影葡胺液面上，水平離心2000rpm×20min；

吸取離心后云霧層的液體，置于一短中管中，并加入5倍以上體積的磷酸鹽緩沖液、Hank′s液或RPMI1640；

1500rpm×10min洗滌重懸離心3次，獲得單核淋巴細胞。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述將單核淋巴細胞進行熒光染色的步驟包括：

將500ugCFSE和90uL二甲基亞楓混合以制備10mmol/L的CFSE母液；

利用磷酸鹽緩沖液將所述CFSE母液稀釋至2umol/L；

取100ml稀釋后的CFSE母液與100ml單核淋巴細胞懸液混合染色，獲得1umol/L的CFSE熒光單核淋巴細胞懸液，其中，所述染色孵育溫度為37℃，時間為15～20min。

6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述將染色后的單核淋巴細胞輸注至所述食蟹猴掌側大魚際下方的結締組織中的步驟包括：將所述CFSE熒光單核淋巴細胞懸液輸注至所述食蟹猴掌側大魚際下方的結締組織中；

其中，所述CFSE熒光單核淋巴細胞懸液輸注至所述食蟹猴內的體積為0.5ml。

7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述再次采集與所述輸注位置同側的食蟹猴腋窩處的淋巴結，并對再次采集的淋巴結采用流式細胞儀進行檢測的步驟包括：

輸注所述CFSE熒光單核淋巴細胞后1h、2h、3h、4h分別采集與所述輸注位置同側的食蟹猴腋窩處的淋巴結；

采用步驟利用密度梯度離心法獲取所述淋巴結中的單核淋巴細胞的方法獲取熒光單核淋巴細胞；

將所述獲取的熒光單核淋巴細胞通過流式細胞儀進行檢測。

8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，所述利用密度梯度離心法獲取所述淋巴結中的單核淋巴細胞的步驟之后包括：

將所述單核淋巴細胞重懸；

取所述懸液與臺盼蘭染液混合，加至細胞計數板上，計算細胞個數。

9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，所述將單核淋巴細胞進行熒光染色的步驟之后包括：

取CFSE熒光單核淋巴細胞懸液與臺盼藍溶液混合，加至細胞計數板，計數活細胞和死細胞的數量。