[發明專利]一種人不典型慢性粒細胞性白血病細胞株及其制備方法

有效

• 申請號: 201310596183.3
• 申請日: 2013-11-22
• 公開（公告）號: CN103667192A
• 公開（公告）日: 2014-03-26
• 發明（設計）人: 劉紅;錢娟;劉杰
• 申請（專利權）人: 南通大學附屬醫院
• 主分類號: C12N5/09
• 分類號: C12N5/09;C12Q1/02;A61K35/12;A61P35/02
• 代理公司: 上海順華專利代理有限責任公司 31203
• 代理人: 陳淑章

技術領域

本發明屬于白血病細胞株技術領域，具體涉及一種人不典型慢性粒細胞性白血病細胞株NT-1及其制備方法。

背景技術

白血病細胞株在白血病的基礎研究中具有重要的地位，采用細胞株在體外進行實驗及動物模型的構建，不僅能從分子、基因水平深入研究腫瘤發生和發展機理，而且對臨床的早期診斷、藥物篩選和治療具有重要意義。

目前國內外文獻報道，并常用于白血病診斷及治療研究的白血病細胞株包括：人早幼粒急性白血病細胞株HL-60、人慢性髓系白血病細胞株K562等。

人不典型慢性粒細胞性白血病（英文全稱，簡稱aCML），為慢性白血病中的一種罕見類型，起病緩慢，早期多無明顯癥狀，往往在體格檢查或其他疾病就診時偶然發現脾腫大或白細胞異常，早期診斷困難。目前臨床也沒有較佳的治療方案，預后差，中位生存年齡僅14-25個月。骨髓細胞染色體核型異常可高達80%，最常見的是+8和del(20q)，20-40%的患者演變為急性白血病，其余患者常死于骨髓衰竭。到目前為止，對aCML的治療經驗很少，尚無滿意的治療方法。目前報道應用地西他濱治療aCML，7例患者中有4例獲得血液學改善，主要不良反應是重度骨髓抑制。

因此，篩選并獲得穩定的人不典型慢性粒細胞性白血病細胞株，建立體外的aCML模型，將對人不典型慢性粒細胞性白血病的早期診斷及藥物篩選具有重要意義。

發明內容

本發明的目的在于提供一種人不典型慢性粒細胞性白血病細胞株NT-1，本發明另一目的在于提供該人不典型慢性粒細胞性白血病細胞株NT-1的制備方法及其應用。

本發明的第一方面，是提供了一種人不典型慢性粒細胞性白血病細胞株NT-1，其保藏號為CCTCC?NO：C2013103，于2013年8月1日保藏于中國典型培養物保藏中心。

本發明人從一名不典型慢性粒細胞性白血病（aCML）患者的骨髓中獲得該白血病細胞株的原代細胞。

本發明應用體外細胞培養技術建立人髓系細胞株，采用細胞株作為實驗對象，分析細胞的形態學、遺傳學、免疫表型、裸鼠致瘤率等特點，為進一步研究aCML的發病機制及治療提供有效且穩定的細胞模型。

本發明的第二方面，是提供了上述的一種人不典型慢性粒細胞性白血病細胞株NT-1的制備方法，該方法包括以下步驟：

1.原代培養：

抽取該患者骨髓1-5ml，枸櫞酸鈉抗凝；用等體積的PBS液稀釋全血；取等體積的Ficoll-Hypaque淋巴細胞分離液加入10-30ml錐形離心管中，升至室溫（18-25℃）；將離心管傾斜45°，用玻璃吸管吸取稀釋后的血液樣品，在分層液面上1cm處沿著管壁緩慢鋪到淋巴細胞分離液上面，注意勿打亂液層界面；配平后置于水平離心機，在室溫下2000r/min，離心15-30分鐘；將離心管平穩取出，血漿層與分層液交界處為一渾濁的灰白色層，富含單個核細胞；用無菌吸管輕輕插入到單個核細胞層，沿著管壁吸取該層，放入另一已預先盛有10-20mlPBS的試管中；將所獲得的單個核細胞在室溫下1500r/min離心10-20min，棄上清，重復洗滌1-2次，除去血小板、分離介質和抗凝物質；加入IMDM完全培養基重懸細胞，并計數細胞；置于37℃，5﹪二氧化碳培養箱內。

2.傳代：

將在IMDM完全培養基中的懸浮細胞，培養于培養皿，首先用細胞計數板計數細胞，當細胞數翻倍時，進行傳代：在超凈工作臺內，無菌條件下，吸除培養皿內培養基，轉移入無菌離心管，1500r/min，棄上清，加入IMDM完全培養基，重懸細胞，吹打均勻后依次轉移入培養皿。

3.凍存和復蘇

凍存：凍存前24小時更換新鮮的IMDM完全培養基，使細胞處于指數生長期。在超凈工作臺內，無菌條件下，吸除培養皿內培養基，轉移入無菌離心管，1500r/min，離心5-10分鐘，棄上清，加入含IMDM完全培養基，調整細胞濃度為1*10⁶～2*10⁶/ml，分裝細胞懸液至EP管，每管為1ml細胞懸液，大約1*10⁶～2*10⁶個細胞數，再次離心，1500r/min，離心5-10分鐘，棄上清，細胞沉淀加入1-3ml凍存液，吹打均勻，移入無菌凍存管，4℃30分鐘，-20℃60分鐘，-80℃過夜，次日移入液氮。