[發明專利]一種桔青霉的固定化方法

有效

• 申請號: 201310595509.0
• 申請日: 2013-11-21
• 公開（公告）號: CN103571818A
• 公開（公告）日: 2014-02-12
• 發明（設計）人: 應漢杰;陳勇;趙南;吳菁嵐;李淑亞;李振建;程浩;劉慶國
• 申請（專利權）人: 南京工業大學
• 主分類號: C12N11/12
• 分類號: C12N11/12;C12R1/80
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 肖明芳

技術領域

本發明屬于工業生物技術領域，涉及桔青霉的固定化方法。

背景技術

核酸酶P1是具有重要應用價值的酶制劑，主要催化特性為裂解RNA和DNA中的3’,5’-磷酸二酯鍵，生成5’-核苷酸以及在低溫環境下分解單核苷酸和寡核苷酸中的3’-磷酸單酯鍵，是核苷酸工業生產中必不可少的原料。核酸酶P1的生產通常采用固體或液體發酵。固體發酵簡便、成本低，但占地面積大、生產效率低，而且產生的分生孢子易污染環境。深層發酵避免了上述缺點，但成本較高。

隨著固定化技術的快速發展，現該技術已廣泛應用于生物發酵領域。將桔青霉菌絲體固定在谷梗或其他一些惰性材料上，重復使用，既降低了發酵液粘度，利于氧氣及營養物質的傳遞，提高了細胞利用率和生物反應速率，同時也便于產物的分離提取等后處理加工。近年來，核酸酶P1的固定化發酵生產得到了越來越多的關注。

目前應用于桔青霉的固定方法常見的有吸附法和包埋法。夏黎明等利用吸附固定在多孔聚酯載體上的桔青霉菌絲生產核酸酶，酶活可高達513U/mL，其產酶效率是游離菌絲的3.6倍，連續生產28批，產酶水平沒有下降，平均酶活達到507U/mL。王克明等先使用玉米芯顆粒吸附桔青霉孢子，再用質量分數為1.5%的海藻酸鈉包埋吸附固定化細胞玉米芯顆粒，于搖瓶中培養50h后，發酵液中核酸酶P1的活力高達503U/mL，并經過了30批次連續重復發酵產酶穩定在較高水平。宋威等采用聚乙烯醇與海藻酸鈉比例為2︰1的復合載體固定桔青霉的孢子，連續發酵20個周期后，生產的核酸酶酶P1活力損失不大，始終保持在468～501U/mL。但是，為了更進一步提高核酸酶P1的生產效率，簡化生產工藝，降低生產成本，仍需要尋找更加天然、高效的固定化材料。

近年來，以纖維材料作為固定化介質的纖維床生物反應器作為一種新型固定化方法受到了廣泛關注。用纖維材料做固定材料，不僅工藝穩定，無毒，廉價易得，吸附效果好，重復使用率高，而且對細胞活性具有較好的保護作用，但目前為止纖維材料作為固定材料而應用于核酸酶P1的發酵卻鮮有報道。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種穩定高效的桔青霉的固定化方法。

為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案如下：

一種桔青霉的固定化方法，以經過預處理的纖維材料作為固定化介質，將核酸酶P1的生產菌株桔青霉活化后接入發酵容器中培養24～60h，使菌株在培養過程中吸附于纖維材料上。

其中，所述的纖維材料為棉纖維織物、活性炭纖維、納米纖維、竹纖維、聚乙烯醇纖維、聚氨酯泡沫、絲綢、細菌纖維素膜、絲瓜瓤和甘蔗渣中的任意一種或幾種。

其中，所述的預處理，具體步驟如下：

（1）將纖維材料在沸水中煮沸后烘干；

（2）將經過步驟（1）處理后的纖維材料置于濃度為1～100g/L的表面改性劑水溶液中浸泡1～20小時，并用鹽酸調節溶液的pH值至7.0，再將纖維材料置于去離子水中充分漂洗后烘干；

（3）將經過步驟（2）處理后的纖維材料置于濃度為1～100g/L的交聯劑水溶液中浸泡1～20小時，再將纖維材料置于去離子水中充分漂洗后烘干，保存備用。

所述的表面改性劑為聚乙烯亞胺、聚醚酰亞胺、丁二酰亞胺、二乙三胺和二甲胺基丙胺中的任意一種或幾種；所述的交聯劑為戊二醛、乙二醛、琥珀醛、2-甲基-1,3-丙二醛和(2S,3R)-2,3-二羥基丁二醛中的任意一種或幾種。

其中，當發酵容器為搖瓶時，纖維材料以50g/L的添加量平鋪固定于搖瓶底部的不銹鋼絲圈上。

其中，當發酵容器為氣升式發酵罐時，將纖維材料裁剪成長條狀，沿垂直方向螺旋纏繞在多條不銹鋼絲條上，如圖1所示。

其中，當發酵容器為自吸式發酵罐時，將纖維材料平鋪在與之大小形狀均相同的鋼絲網上，纖維材料與鋼絲網一起卷成筒狀，如圖2所示。

有益效果：相對于現有技術，本發明優勢如下：

1、本發明所采用的纖維材料為化學惰性，對細胞沒有毒害作用，機械強度高，也不會被細胞代謝分解，不影響微生物的生長代謝，死細胞自行脫落，而活細胞能夠實現自增殖過程，始終維持很高的催化效率。