[發(fā)明專利]檢測(cè)羊痘病毒膠體金試紙條及其制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310594930.X
• 申請(qǐng)日: 2013-11-21
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104407130A
• 公開(kāi)（公告）日: 2015-03-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王海艷;趙治國(guó);敖威華;郭鐵箏;潘國(guó)卿;高利;李剛;趙林立;吳紹強(qiáng);周艷君
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 王海艷
• 主分類號(hào): G01N33/569
• 分類號(hào): G01N33/569
• 代理公司: 北京康思博達(dá)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11426
• 代理人: 余光軍

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種膠體金試紙條，尤其涉及一種檢測(cè)羊痘病毒膠體金試紙條及其制備方法，屬于羊痘病毒的檢測(cè)領(lǐng)域。?

背景技術(shù)

羊痘是由羊痘病毒屬的綿羊痘病毒或山羊痘病毒(goatpox?virus，GTPV)引起的綿羊或山羊的一種急性、熱性、接觸性傳染病。主要表現(xiàn)為發(fā)熱，無(wú)毛或少毛部位的皮膚或黏膜發(fā)生丘疹和皰疹。羊痘是所有動(dòng)物痘病中最為嚴(yán)重的一種，病死率高，造成的經(jīng)濟(jì)損失大，嚴(yán)重影響國(guó)際貿(mào)易和養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展。此外，本病在公共衛(wèi)生方面也有重要意義，中國(guó)、蒙古、瑞典、印度都有人類感染羊痘病毒的報(bào)道，受到世界各國(guó)的高度重視，世界各國(guó)都嚴(yán)格限制從有本病存在的國(guó)家和地區(qū)進(jìn)出口易感動(dòng)物及其有關(guān)的產(chǎn)品。?

目前，羊痘的診斷方法主要有血清學(xué)診斷方法、分子生物學(xué)診斷方法以及病毒培養(yǎng)和電鏡觀察方法。雖然以上方法的建立在羊痘的預(yù)防、診斷和監(jiān)測(cè)中發(fā)揮了重要作用，但由于其操作復(fù)雜、耗時(shí)并且需要特殊的儀器設(shè)備而使其在現(xiàn)場(chǎng)檢驗(yàn)檢疫中受到限制，所以建立快速、敏感、特異并能用于羊痘現(xiàn)場(chǎng)直接檢疫的方法迫在眉睫。?

免疫膠體金技術(shù)在人類醫(yī)學(xué)上是一種常用的免疫標(biāo)記技術(shù)，有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，在生物醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域中得到了日益廣泛的應(yīng)用。目前該技術(shù)在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用主要是膠體金快速免疫層析法和快速斑點(diǎn)免疫金滲濾法，用于檢測(cè)人類乙肝表面抗原、人絨毛膜促性腺激素、艾滋病病毒等。近幾年隨著該技術(shù)的不斷發(fā)展，已在獸醫(yī)臨床上得到了廣泛應(yīng)用。免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物，應(yīng)用于抗原抗體反應(yīng)中的一種新型免疫標(biāo)記技術(shù)。膠體金顆粒之間因靜電作用形成一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，也稱金溶膠。膠體金?標(biāo)記就是蛋白質(zhì)等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過(guò)程。吸附機(jī)理是膠體金顆粒表面的負(fù)電荷與蛋白質(zhì)的正電荷基團(tuán)靜電吸附而形成牢固結(jié)合。用還原法可以方便地從氯金酸制備各種不同粒徑，也就是不同顏色的膠體金顆粒。這種球形的粒子對(duì)蛋白質(zhì)有很強(qiáng)的吸附功能，可以與葡萄球菌A蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白多肽等非共價(jià)結(jié)合，因而在基礎(chǔ)研究和檢驗(yàn)檢疫中成為非常有用的工具。免疫膠體金顆粒具有高電子高密度的特性，在顯微鏡下金標(biāo)蛋白結(jié)合處，可見(jiàn)黑褐色顆粒，當(dāng)這些標(biāo)記物在相應(yīng)的配體處大量聚集時(shí)，肉眼可見(jiàn)紅色或粉紅色斑點(diǎn)，因而可用于定性或半定量的快速免疫檢測(cè)。?

膠體金免疫層析技術(shù)具有簡(jiǎn)單、快速、靈敏、可現(xiàn)場(chǎng)操作等優(yōu)點(diǎn)，本研究擬應(yīng)用膠體金免疫層析技術(shù)，建立羊痘病毒快速檢測(cè)試紙條，為羊痘病毒的檢測(cè)提供特異性強(qiáng)、靈敏度高、方便快捷的方法。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的之一是提供一種檢測(cè)羊痘病毒膠體金試紙條；?

本發(fā)明的目的之二是提供一種制備檢測(cè)羊痘病毒膠體金試紙條的方法。?

本發(fā)明的上述目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：?

本發(fā)明首先提供了一種檢測(cè)羊痘病毒膠體金試紙條，包括：樣品墊、金標(biāo)結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸收墊和被襯；其中，樣品墊、金標(biāo)結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸收墊依次粘附于不吸水的支撐薄片上；所述金標(biāo)結(jié)合墊是結(jié)合有金標(biāo)記抗羊痘病毒P32蛋白單克隆抗體的玻璃纖維膜；在硝酸纖維素膜上各有一條由兔抗P32蛋白IgG噴制成的檢測(cè)線以及由羊抗鼠多克隆抗體噴制成的質(zhì)控線，其中檢測(cè)線靠近金標(biāo)結(jié)合墊，質(zhì)控線靠近吸收墊。?

硝酸纖維素膜的種類對(duì)于檢測(cè)結(jié)果的特異性、靈敏度、顯色帶寬度及背景顏色等方面有顯著的影響，為了提升檢測(cè)的特異性、靈敏度并便于觀察，本發(fā)明分別考察了不同種類的硝酸纖維素膜對(duì)于檢測(cè)結(jié)果的影響，最?終發(fā)現(xiàn)，Millipore?HF135膜在流速、特異性、靈敏度、顯色帶寬度及背景顏色等方面都比較適合，尤為重要的是其在層析反應(yīng)中性能良好；因此，本發(fā)明優(yōu)選Millipore的Miliipore?HF135膜作為本發(fā)明檢測(cè)羊痘病毒膠體金試紙條的硝酸纖維素膜。?

檢測(cè)線和質(zhì)控線的間隔優(yōu)選為3.0-10.0mm,優(yōu)選為5.0mm。?

所述的背襯可以是PVC板、木板、金屬板等各種不吸水的具有支撐作用的薄片。?

本發(fā)明的另外一個(gè)目的是提供一種制備所述檢測(cè)羊痘病毒膠體金試紙條的方法，該方法包括：?

（1）制備金標(biāo)結(jié)合墊：將玻璃纖維膜用封閉液封閉；將金標(biāo)記抗羊痘病毒P32蛋白單克隆抗體稀釋后涂覆于用封閉液封閉的玻璃纖維膜上，干燥后備用；?

（2）制備含有檢測(cè)線和質(zhì)控線的硝酸纖維素：將兔抗P32蛋白IgG以及羊抗鼠多克隆抗體分別用包被緩沖液稀釋后噴印在硝酸纖維素膜上形成檢測(cè)線和質(zhì)控線，干燥后備用；?

（3）制備樣品墊：將玻璃纖維膜用封閉液封閉后，干燥即得；?