[發明專利]一種云南省松茸的產地屬性DNA指紋圖譜的建立方法

有效

• 申請號: 201310594661.7
• 申請日: 2013-11-21
• 公開（公告）號: CN103571966A
• 公開（公告）日: 2014-02-12
• 發明（設計）人: 陳麗萍;陳蕓;劉忠民;趙永昌;陳立佼;陳衛民;李樹紅;岳亮亮;李旻;丁元明;楊玲春;滕平;王裔耿;李云飛;殷紅;陳宏仙;顏慶;傅士華
• 申請（專利權）人: 云南出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 昆明大百科專利事務所 53106
• 代理人: 何健

1.一種云南省松茸的產地屬性DNA指紋圖譜的建立方法，使用以下pL281/pS48引物、

pDGSL313-1/pS48引物、pDGSL719-2/pS48引物的引物序列，引物序列分別為：pL281：

CTTCACATATACTGGGCATCAGCAAGGG；pS48：

GAGGTGGGGAAAAATATGGGACGAAC；pDGSL313-1：

CGATGTATGTGGCTGTGCCAGTACCAT；pDGSL719-2：

TGGGCCGCCCTTGATGGCTCATATT；其特征在于，包括如下步驟：

1）樣品DNA提取：對云南各松茸產區的松茸樣品進行DNA提取；

2）按順序使用pL281/pS48引物、pDGSL313-1/pS48引物、pDGSL719-2/pS48引物對提取的松茸樣品的DNA進行PCR擴增；

3）運用QIAxcel全自動DNA分析系統進行產物檢測；

4）獲得云南松茸的產地特征屬性DNA指紋圖譜。

2.根據權利要求1所述的一種云南省松茸的產地屬性DNA指紋圖譜的建立方法，其特征在于，該方法的具體參數為，

1)樣品DNA提取：取每個地區的鮮松茸樣本菌褶部分500mg，以一個子實體用一個指套放入一次性PE手套為原則，放入一次性指套中捻碎；必須選擇使用非過柱離心的可破碎細胞壁的商業DNA提取試劑盒提取新鮮樣本的DNA；

2)按順序使用pL281/pS48引物、pDGSL313-1/pS48引物、pDGSL719-2/pS48引物對提取的松茸樣品的DNA進行PCR擴增；其中，PCR的反應體系和檢測條件：Premix?Taq?Version2.010μL，上游引物0.5μM，下游引物0.5μM，DNA25-50ng，補ddH₂O至20μL，混合均勻后，94℃2min；94℃30sec，退火溫度30sec，72℃1min，30個循環；72℃10min。退火溫度：pL281/pS48引物體系64℃，pDGSL313-1/pS48引物體系64℃，pDGSL719-2/pS48引物體系68.5℃；

3）運用QIAxcel全自動DNA分析系統進行產物檢測：pDGSL719-2/pS48引物擴增的產物采用DNA?Screening?kit卡夾執行AL300程序進行核酸分析；pL281/pS48引物擴增的產物和pDGSL313-1/pS48引物擴增的產物采用DNA?High?Resolution?kit卡夾執行分辨率適度的OM500程序進行核酸分析；

4）獲得云南省松茸的產地特征屬性DNA指紋圖譜。

3.根據權利要求2所述的一種云南省松茸的產地屬性DNA指紋圖譜的建立方法，其特征在于，按照該步驟即得到云南省大理白族自治州劍川縣東山鄉、云南省楚雄彝族自治州南華縣五街鎮地區的松茸產地屬性DNA指紋圖譜。

4.根據權利要求2所述的一種云南省松茸的產地屬性DNA指紋圖譜的建立方法，其特征在于，該方法在步驟3）后還包括如下步驟：

a）單酶限制性酶切體系：10×QuickCut^TM?Buffer?1μL，QuickCut^TM?EcoR?V0.1μL，DNA25-50ng，補ddH₂O至10μL，混合均勻后，37℃10min；

b）再次進行pL281/pS48的PCR反應體系：限制性酶切體系10μL，Premix?Taq?Version2.09.8μL，上游引物0.5μM，下游引物0.5μM；

即得到云南省大理白族自治州劍川縣老君山上蘭鄉、云南省大理白族自治州喜州鎮、云南省大理白族自治州賓川縣、云南省大理白族自治州祥云縣、云南省迪慶藏族自治州香格里拉縣的松茸產地屬性DNA指紋圖譜。

5.根據權利要求2所述的一種云南省松茸的產地屬性DNA指紋圖譜的建立方法，其特征在于，該方法在步驟3）后還包括如下步驟：

a)混合酶限制性酶切體系：10×QuickCut^TM?Buffer1μL，10×QuickCut^TM?Buffer1μL，QuickCut^TM?EcoR?V0.1μL，QuickCut^TM?Sph?I0.1μL，DNA1μL，補ddH₂O至10μL，混合均勻后，37℃10min；

b)再次進行pL281/pS48的PCR反應體系：限制性酶切體系10μL，Premix?Taq?Version2.09.8μL，上游引物0.5μM，下游引物0.5μM；

即得到云南省怒江傈僳族自治州蘭坪白族普米族自治縣和云南省麗江市納西族自治縣玉龍石鼓鎮的松茸產地屬性DNA指紋圖譜。