[發明專利]一種褪黑素半抗原、褪黑素完全抗原及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201310593798.0
• 申請日: 2013-11-21
• 公開（公告）號: CN103601662A
• 公開（公告）日: 2014-02-26
• 發明（設計）人: 王鐵杰;殷果;韓東岐;魯藝;王玨;秦斌;譚渺;閆研;關瀟瀅;黎雪清;王防修;蔣永青
• 申請（專利權）人: 深圳市藥品檢驗所
• 主分類號: C07D209/14
• 分類號: C07D209/14;C07K14/765;C07K14/77;C07K14/795;C07K14/75;C07K14/47;C07K14/465;C07K1/107;G01N33/53
• 代理公司: 廣州三環專利代理有限公司 44202
• 代理人: 郝傳鑫;熊永強

技術領域

本發明涉及生物醫藥材料領域，具體涉及一種褪黑素半抗原、褪黑素完全抗原及其制備方法和應用。

背景技術

免疫分析是以抗原與抗體之間特異性識別和可逆性結合反應為基礎的痕量分析方法，其不僅適用于大分子化合物（如蛋白質、核酸、細菌）的檢測，也適用于小分子化合物（如激素、藥物）的測定。建立小分子化合物的免疫分析方法的關鍵是能夠制備出對小分子化合物具有高親和力和高選擇性的抗體。由于大多數小分子化合物的分子量小于1000，不具有免疫原性，即缺乏T細胞表位而無法直接誘導動物機體等產生特異性抗體。然而，小分子化合物可以通過適當的化學修飾方法，與大分子載體結合，生成小分子化合物-大分子載體的偶聯物，此偶聯物即為完全抗原，它可以借助T細胞表位來間接誘導B細胞的增殖及分化，產生特異性抗體。

褪黑素（Melatonin,MLT）是一種小分子物質，化學名為N-乙酰-5-甲氧基色胺，分子量僅為232.28D，不具有免疫原性，用于免疫，必須先與蛋白質大分子載體結合，形成褪黑素-蛋白質載體偶聯的完全抗原后才具免疫原性。然而，制備褪黑素-蛋白質載體偶聯的完全抗原不能影響褪黑素的空間構象，而且需要保持褪黑素抗原決定簇（如5-甲氧基、N-烷基側鏈）的有效性，才能獲得效價高、特異性強的褪黑素抗體。因此，如何制備具有良好免疫原性的完全抗原是建立測定褪黑素的免疫分析方法的難點。

發明內容

為解決上述問題，本發明第一方面，本發明提供了一種褪黑素半抗原；

第二方面提供了一種褪黑素完全抗原，該褪黑素完全抗原能充分暴露褪黑素的抗原決定簇，并保持褪黑素的空間構象，以該褪黑素完全抗原為免疫原制備的單克隆抗體和多克隆抗體對褪黑素具有較高的特異性和靈敏性；

本發明第三方面還提供了一種褪黑素半抗原的制備方法，該制備方法將褪黑素進行硝化、還原、衍生化并水解后，制得了含連接臂的褪黑素半抗原，

本發明第四方面還提供了一種褪黑素完全抗原的制備方法，該方法將該褪黑素半抗原再與載體蛋白進行偶聯，即得到褪黑素完全抗原；

本發明第五方面還提供了一種褪黑素完全抗原的應用。

第一方面，本發明提供了一種褪黑素半抗原，結構式如P1所示：

第二方面，本發明提供了一種褪黑素完全抗原，結構式如P2所示：

式中，k為1～5的自然數，R為載體蛋白，n為10～20的自然數。

優選地，所述載體蛋白為球蛋白、牛血清白蛋白、雞卵清蛋白、鑰孔血藍蛋白、兔血清白蛋白、人血清白蛋白、甲狀腺球蛋白、纖維蛋白原、兔丙種球蛋白或雞的丙種球蛋白。

本發明提供的褪黑素完全抗原分子包括褪黑素分子和載體蛋白，所述褪黑素分子和載體蛋白通過連接臂進行連接，所述連接臂優選為含羧基的直鏈烷基，其含有的活性基團羧基能保證褪黑素分子和載體蛋白上的自由氨基進行反應并偶聯，此外，該連接臂的修飾位點位于苯環上，離褪黑素分子的抗原決定簇N-烷基側鏈比較遠，當褪黑素與載體蛋白偶聯后有利于褪黑素N-烷基側鏈的暴露，其次，該連接臂的碳鏈含碳原子比較適中，且具有和褪黑素N-烷基側鏈類似的原子構成和結構，不易誘導機體產生臂抗體。以該褪黑素完全抗原為免疫原制備的單克隆抗體和多克隆抗體對褪黑素具有較高的特異性和靈敏性。

所述褪黑素分子和載體蛋白的偶聯比n的取值范圍為10～20，即每個載體蛋白分子上連接的褪黑素分子的平均數目為10～20，在該偶聯比下得到的完全抗原既不影響褪黑素分子的空間結構，使其具有良好的免疫原性，從而有利于將本發明制備的完全抗原應用于各種免疫層析檢測試劑盒中。

第二方面，本發明還提供了一種褪黑素半抗原的制備方法，包括如下步驟：

S10、提供褪黑素，其結構式如A所示：

將所述褪黑素和硝酸鹽按1:1.05～1:1.1的摩爾比溶于85%～98%濃硫酸中，得到反應液，所述反應液在0～5℃下進行硝化反應2～3小時后，經調節pH值至堿性，隨后進行分離純化，得到化合物B，其結構式如B所示：

S20、酸性條件下，將所述化合物B和還原性金屬按1:10～1:20的摩爾比溶于第一有機溶劑中得到反應液，所述反應液在70～80℃下進行還原反應2～4小時后，經調節pH值至堿性，隨后進行抽濾得到濾液，所得濾液經萃取、過柱，得到化合物C，其結構式如C所示：