[發(fā)明專利]rsmA基因在植物根表定殖和促生方面的應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310593220.5
• 申請(qǐng)日: 2013-11-20
• 公開（公告）號(hào): CN103614410A
• 公開（公告）日: 2014-03-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 燕永亮;尚立國(guó);戰(zhàn)崳華;林敏
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所
• 主分類號(hào): C12N15/78
• 分類號(hào): C12N15/78;C12N1/21;C05F11/08;C12R1/38
• 代理公司: 北京海虹嘉誠(chéng)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11129
• 代理人: 張濤

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及rsmA基因在植物根表定殖和促生方面的應(yīng)用。

技術(shù)背景

rsmA基因是在革蘭氏陰性菌中廣泛存在的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子。在有些細(xì)菌的報(bào)道中，提到該基因參與微生物的中心碳代謝、菌體運(yùn)動(dòng)、生物膜及致病性等相關(guān)的生理過程，但是尚未見報(bào)道其在參與植物生長(zhǎng)方面的功能。

微生物菌肥中使用的微生物多是從植物根際分離到的植物根際促生菌（PGPR），當(dāng)這些促生菌在植物“根部定殖”，即在植物根表和近根土壤中穩(wěn)定繁殖時(shí)，菌體可以利用植物根分泌的有機(jī)物作為碳源，例如有機(jī)酸，糖類，氨基酸等，這一獨(dú)特的生態(tài)環(huán)境使得植物促生菌大量繁殖，形成非常高的菌密度，然后利用自身的生物固氮、溶磷解鉀、分泌植物激素等方法促進(jìn)植物生長(zhǎng)的作用，實(shí)現(xiàn)植物-微生物互惠互利的高效共生關(guān)系。

固氮施氏假單胞菌A1501是我國(guó)科學(xué)家分離到的一株聯(lián)合固氮菌。但是在田間環(huán)境下存在的眾多的土著微生物會(huì)與A1501競(jìng)爭(zhēng)氮素、碳素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。因此，大幅提高固氮施氏假單胞菌A1501在植物根部的定殖能力，使其在眾多的根際微生物中獲得競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，大量定殖到植物根表并發(fā)揮促生作用，非常重要。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是尋找有關(guān)參與固氮施氏假單胞菌水稻根部定殖和促生相關(guān)的基因。

本發(fā)明人在其實(shí)驗(yàn)室完成的A1501基因組中找到rsmA基因，該基因在A1501基因組中編號(hào)（Locus?tag）為PST1371，對(duì)應(yīng)的蛋白編碼在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)編號(hào)是ABP79066.1。本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了rsmA基因參與固氮施氏假單胞菌在植物根部定殖和促生方面的功能。研究表明，該基因的存在對(duì)微生物在根表的定向運(yùn)動(dòng)及高效定殖具有負(fù)調(diào)控作用，通過基因敲除、基因突變等有效手段使該基因的功能喪失后可以提高菌株在固體介質(zhì)上的運(yùn)動(dòng)能力，并在植物根表產(chǎn)生更強(qiáng)的定殖能力，進(jìn)而促進(jìn)植物的生長(zhǎng)。

即，rsmA基因作為負(fù)調(diào)控因子行使功能，當(dāng)通過基因工程的手段使該基因的功能缺失后，獲得的基因工程菌株具有更高的運(yùn)動(dòng)能力、生物膜合成能力以及更強(qiáng)的水稻根部定殖和促生能力。本發(fā)明涉及所述的突變菌的產(chǎn)生方法及其產(chǎn)生的菌株在微生物肥料產(chǎn)業(yè)中具有應(yīng)用前景。

基因組分析表明，在固氮施氏假單胞菌A1501中存在一個(gè)跟大腸桿菌csrA的氨基酸序列87%的相似度，和銅綠假單胞菌rsmA基因氨基酸序列同源性高達(dá)97%的類似物。我們通過同源重組的方法對(duì)固氮假單胞菌中的rsmA基因進(jìn)行整合突變使其功能缺失。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，突變株在固體培養(yǎng)基上菌落形態(tài)發(fā)生明顯的變化，菌落變得干燥，不易從培養(yǎng)基上剝離。野生型A1501在含0.5%瓊脂的LB平板上，幾乎不發(fā)生swarm運(yùn)動(dòng)，但RsmA突變株的swarm運(yùn)動(dòng)能力極大的增強(qiáng)，此外，RsmA的突變導(dǎo)致了菌體生物薄膜生成量明顯增加。此外，通過接種野生型及突變株菌株于水稻幼苗根部，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，rsmA功能的缺失導(dǎo)致了固氮假單胞菌在水稻根部定殖能力和促生能力都大幅增強(qiáng)。

本發(fā)明人通過對(duì)Pseudomonas?stutzeri?A1501的全基因組序列和基因注釋分析，發(fā)現(xiàn)構(gòu)建rsmA基因功能缺失的突變株可以用于生產(chǎn)增強(qiáng)固氮作用的微生物菌肥。

上述構(gòu)建rsmA基因功能缺失的突變株可以采用多種形式，如整合突變方式，也可以采用缺失突變，點(diǎn)突變等方式，只要能夠使rsmA基因功能缺失就可以得到相似的表型和實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)例中，采用同源重組的方式對(duì)rsmA基因進(jìn)行整合突變，獲得了rsmA基因功能缺失突變株。本發(fā)明對(duì)所得到的上述rsmA突變株進(jìn)行了如下測(cè)定，證明其可高效定殖水稻，小麥，玉米等禾本科農(nóng)作物根部，并對(duì)植物有促生長(zhǎng)作用：

1）菌體swarming運(yùn)動(dòng)

即，測(cè)定菌體在瓊脂含量為0.4%-0.7%的半固體培養(yǎng)基表面上運(yùn)動(dòng)擴(kuò)散，發(fā)現(xiàn)突變株在固體界面上的swarming運(yùn)動(dòng)能力顯著增強(qiáng)，這可以導(dǎo)致菌體在水稻根表定殖后，通過swarming運(yùn)動(dòng)形式從定殖初始位點(diǎn)向周圍擴(kuò)張擴(kuò)大定殖的面積，使菌體廣泛占據(jù)植物的根表，獲得更好的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，在與其他土著微生物的競(jìng)爭(zhēng)中占據(jù)先機(jī)。

2）生物膜形成（細(xì)菌在固體表面形成一種具有一定三維空間結(jié)構(gòu)的多細(xì)胞結(jié)構(gòu)，被稱為生物膜），發(fā)現(xiàn)突變株生物膜的生成能力增強(qiáng)，證明rsmA的突變促進(jìn)了施氏假單胞菌生物膜的形成。生物膜的形成對(duì)于固氮微生物是非常重要的，形成了生物膜這種特殊的結(jié)構(gòu)，微生物的生長(zhǎng)、固氮等多種生理反應(yīng)才能夠被激活并穩(wěn)定進(jìn)行。

3）水稻根表競(jìng)爭(zhēng)性定殖實(shí)驗(yàn)