[發(fā)明專利]提高外源蛋白表達(dá)的增強(qiáng)子樣基因及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310591154.8
• 申請(qǐng)日: 2013-11-22
• 公開（公告）號(hào): CN103602684A
• 公開（公告）日: 2014-02-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 井申榮;閆沁男;王應(yīng)明;曾韋錕;黃芬
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 昆明理工大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/113
• 分類號(hào): C12N15/113;C12N15/70
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種提高外源蛋白表達(dá)的增強(qiáng)子樣基因序列，用于提高外源蛋白在原核細(xì)胞中的表達(dá)水平。?

背景技術(shù)

目前，已經(jīng)開發(fā)出的蛋白表達(dá)系統(tǒng)有多種，常用的有大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、酵母表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)等。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)雖然研究較為成熟，但某些目的蛋白在其中的表達(dá)水平仍然很低；酵母表達(dá)系統(tǒng)也存在外源基因拷貝數(shù)低的問題；哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)更是存在外源基因不能持久表達(dá)、成本高及技術(shù)復(fù)雜的問題。因此，在這些常用的表達(dá)系統(tǒng)中，某些外源基因表達(dá)水平低仍然是亟待解決的難題。?

增強(qiáng)子（enhancer，ER）是一類包含轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的順式作用元件，對(duì)靶基因表達(dá)具有激活及增強(qiáng)作用，它的發(fā)現(xiàn)為提高外源基因表達(dá)水平提供了一個(gè)新的方向。隨著對(duì)原核生物基因表達(dá)調(diào)控研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)原核生物基因組中也存在著一些具有轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)作用的調(diào)控模式，這類序列即稱為增強(qiáng)子樣序列（enhancer-Like?sequence，ERLS）。常用于提高外源蛋白表達(dá)水平的方法主要有增加蛋白表達(dá)標(biāo)簽、優(yōu)化外源基因表達(dá)所需的密碼子以及增加表達(dá)系統(tǒng)中外源基因的拷貝數(shù)等，采用增強(qiáng)子樣基因序列提高外源蛋白表達(dá)水平使用的還較少，而且很多未知的增強(qiáng)子樣序列尚未被發(fā)現(xiàn)。?

增強(qiáng)子長(zhǎng)度通常為100-200bp，與啟動(dòng)子、絕緣子及沉默子等協(xié)同作用調(diào)控基因的時(shí)空表達(dá)。無方向性是它的一個(gè)重要作用特點(diǎn)，即無論位于啟動(dòng)子的上游或下游，均能激活其相應(yīng)的啟動(dòng)子。這種增強(qiáng)活性主要體現(xiàn)在基因表達(dá)的水平上，目前已有少數(shù)增強(qiáng)子樣序列應(yīng)用于提高蛋白表達(dá)水平。?

基因陷阱（gene?trap）是研究基因調(diào)控元件與基因功能的一個(gè)有力工具。該方法已成功地應(yīng)用于果蠅、小鼠、擬南芥等重要模式動(dòng)植物功能基因組的研究（O’Brochta?DA?et?aL,?Proc?NatL?Acad?Sci?USA,?2011,?108(39):?16339-16344），并發(fā)現(xiàn)了大量新基因。本發(fā)明中，增強(qiáng)子樣基因序列的篩選即采用了融合報(bào)告基因和基因陷阱的方法，將人乳頭瘤病毒（Human?Papilloma?virus,?HPV）58型主要衣殼蛋白L1基因的截短序列L11和氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（CAT）融合作為增強(qiáng)子樣序列誘捕載體的報(bào)告基因，當(dāng)增強(qiáng)子樣序列插入后，菌株的氯霉素抗性提高，由此，通過增加氯霉素濃度進(jìn)行大規(guī)模篩選，從而獲得相應(yīng)的能增強(qiáng)基因表達(dá)的序列。?

現(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)的增強(qiáng)子樣序列主要應(yīng)用于增強(qiáng)低分子量蛋白的表達(dá)上，如干擾素、白細(xì)胞介素等。本發(fā)明中所使用的融合報(bào)告基因可表達(dá)出較大的融合蛋白（55KDa），利用該報(bào)告基因篩選的序列也可構(gòu)建出一種高分子量蛋白表達(dá)系統(tǒng)，從而解決一些高分子量蛋白在外源表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)率低的難題。大腸桿菌是重要的基因工程菌，遺傳背景清楚、操作簡(jiǎn)便、快速且成本低廉，成為篩選增強(qiáng)子樣序列的首選。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明旨在提供一種能夠提高外源蛋白表達(dá)水平的原核增強(qiáng)子樣基因，主要目的是要改進(jìn)外源基因的原核表達(dá)系統(tǒng)，該基因具有如SEQ?ID?NO：1所示的核苷酸序列或如SEQ?ID?NO：1中的1~271bp所示的核苷酸序列。?

本發(fā)明首先對(duì)來自于昆明市呈貢區(qū)居民生活污水樣品和昆明市第四十三解放軍總醫(yī)院附近污水處理廠污水樣品中的細(xì)菌進(jìn)行富集，然后抽提細(xì)菌基因組樣品并對(duì)其進(jìn)行酶切，獲得500bp以下的DNA片段，再將其構(gòu)建到增強(qiáng)子樣序列篩選重組質(zhì)粒pET21a-CAT-L11的啟動(dòng)子上游，構(gòu)建基因文庫(kù)，通過融合的氯霉素抗性報(bào)告基因篩選含增強(qiáng)子樣序列的菌株，最后對(duì)菌株的氯霉素抗性和增強(qiáng)子樣序列來源進(jìn)行分析并對(duì)其增強(qiáng)外源蛋白表達(dá)的能力進(jìn)行檢測(cè)。?

本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的：?

（1）構(gòu)建含融合報(bào)告基因的重組篩選菌株

對(duì)云南省第一人民醫(yī)院（云南省昆華醫(yī)院）宮頸癌患者的腫瘤組織樣品進(jìn)行處理后，抽提DNA，通過PCR方法獲得人乳頭瘤病毒HPV58型L1基因的截短序列L11，并構(gòu)建成重組質(zhì)粒pMD18T-L11，將L11片段從pMD18T-L11上酶切下來并通過膠回收純化后，連接至含有報(bào)告基因CAT的重組質(zhì)粒pET21a-CAT上，經(jīng)酶切鑒定及測(cè)序驗(yàn)證，重組質(zhì)粒pET21a-CAT-L11構(gòu)建正確。然后采用熱休克法將重組質(zhì)粒pET21a-CAT-L11轉(zhuǎn)化至大腸桿菌表達(dá)菌株中，獲得重組篩選菌株pET21a-CAT-L11/BL21（DE3）。