[發明專利]一種亞健康康復用自體免疫細胞新技術

在審

• 申請號: 201310589031.0
• 申請日: 2013-11-21
• 公開（公告）號: CN104651307A
• 公開（公告）日: 2015-05-27
• 發明（設計）人: 孫勇
• 申請（專利權）人: 孫勇
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783;C12N5/0784;A61K35/17;A61K35/15;A61P37/04
• 代理公司: 無
• 代理人: 無

1.一種亞健康康復用自體免疫細胞新技術，其特征在于：

(1)亞健康人群篩選，入選者年齡35-55歲成年男女，沒有重大疾病，身體狀況穩定。參與者進行健康問卷、自評、問診、一級檢查和二級檢查。

(2)自體免疫細胞的采集。無菌條件下取得亞健康者靜脈抗凝血，4℃并運至GMP車間。

(3)自體免疫細胞CIK和DC在GMP車間培養誘導。在百級GMP車間條件下，采用Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個核細胞，將分離得到的單個核細胞接種于PRMI1640培養基，并添加細胞因子培養。轉移細胞培養上清液(粘附細胞供DC細胞誘導擴增所用)至另一經anti-CD3單抗包被的培養瓶培養，此為CIK細胞。未轉移的粘附細胞用PRMI1640培養基繼續培養并添加GM-CSF、IL-4及自體血清等培養，此為DC細胞。DC和CIK細胞按照一定比例共培養，并細胞表面分子的表達進行檢測。

(4)免疫細胞制劑的質量控制。細胞培養完成或培養過程中進行各項指標的檢測，這些指標包括：無菌實驗(包括細菌、內毒素和支原體)、生物活性檢測、存活率、細胞純度及細胞鑒定。

(5)細胞移植。臨近移植前做革蘭氏染色，簽署細胞輸注知情者同意書，按照康復計劃將質檢合格的DCIK細胞在無菌條件下靜脈輸注亞健康者本人。

(6)隨訪及康復方案調整。細胞移植后對亞健康者進行健康訪問、復查，并根據康復結果調整康復計劃。

2.根據權利要求1所述的一種亞健康康復用自體免疫細胞新技術，其特征是：所述步序(1)亞健康人群篩選，入選者年齡35-55歲成年男女，沒有重大疾病，身體狀況穩定。參與者進行健康問卷、自評、問診、一級檢查和二級檢查。評價結果符合亞健康標準即疲勞(休息不能緩解的疲勞；往常從事的活動下降50％)加任意6項次要癥狀(①畏寒、低熱，②咽喉不適，③淋巴結腫大，④不能解釋的全身無力感，⑤肌肉酸痛，⑥頭痛，⑦日?；顒雍笃诟胁荒芑貜?，⑧關節疼痛，⑨睡眠紊亂，⑩精神、神經癥狀；急性、亞急性出現)和任意2條體征(①頸淋巴結腫大≤2cm，②低熱，②咽喉炎)，或者疲勞加任意8項次要癥狀。自我評價大于等于50分。一般身體檢查正常，二級檢查包括免疫細胞分類、免疫細胞功能、免疫分子和SOD檢測有三項以上陽性或者高于／低于正常值。

3.根據權利要求1所述的一種亞健康康復用自體免疫細胞新技術，其特征是：所述步序(2)自體免疫細胞的采集。無菌條件下靜脈抽取亞健康者外周血50毫升，肝素(20U／mL)抗凝，混勻并填寫樣本信息表，在4。℃無菌環境下運至100級G?M?P車間加工。

4.根據權利要求1所述的一種亞健康康復用自體免疫細胞新技術，其特征是：所述步序(3)自體免疫細胞在GMP車間培養誘導。在百級G?M?P車間條件下，采用Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個核細胞，將分離得到的單個核細胞按照細胞濃度為5X10⁵／ml接種于PRMI1640培養基，添加1000u／ml?of?IFN-gama、100u／ml?of?IL-1a、500u／ml?of?IL-2細胞因子、100u／ml青霉素、100u／ml鏈霉素，1％自體血清，常規培養24小時。轉移細胞培養上清液(粘附細胞供DC細胞誘導擴增所用)至另一經5ug／ml?of?anti-CD3單抗包被的培養瓶，常規培養7天，此為CIK(cytokine?induced?killer，細胞因子誘導的殺傷細胞)細胞。未轉移的粘附細胞用PRMI1640培養基繼續培養并添加1000u／ml?of?GM-CSF、500u／ml?of?IL-4及2％的自體血清等培養7天，此為DC(dendritic?cells，樹突狀細胞)細胞。將培養7天的DC和CIK細胞以1：3比例混合，培養液為上述CIK細胞培養液，常規培養7天，檢測粘附細胞DC細胞表達CD80、CD40、MHC-DR、IL-12水平及非粘附細胞CIK表達CD28、CD40和CD40L的表達水平。