[發明專利]一種原位判定混合釀造體系中風味功能微生物的方法

有效

• 申請號: 201310587080.0
• 申請日: 2013-11-20
• 公開（公告）號: CN103589773A
• 公開（公告）日: 2014-02-19
• 發明（設計）人: 徐巖;吳群
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02;C12G3/02;A23L1/238;C12J1/00;C12R1/865;C12R1/84;C12R1/85;C12R1/645
• 代理公司: 北京愛普納杰專利代理事務所(特殊普通合伙) 11419
• 代理人: 何自剛;王玉松

技術領域

本發明涉及一種原位判定混合釀造體系中風味功能微生物的方法，屬于微生物技術領域。

背景技術

自然微生態系統在發酵食品生產部門中具有重要地位，酵母群落在白酒、干酪、酸奶、酒釀等多個工業部門中都具有重要的用途。這些傳統食品生產工業是我國傳統優勢產業之一，歷史悠久、文化底蘊深厚，是國民經濟發展中增長最快、最具活力的產業之一。傳統發酵食品釀造工藝往往比較復雜，包括若干個工藝階段或者若干個工藝組成部分。比如說茅臺酒的釀造工藝一年一個周期，投料兩次，總共要經過八次發酵，八次蒸酒。在整個釀造過程中，酵母群落的活動會改變系統中的物理、化學參數以及營養的組成，從而影響下一次發酵時的酵母群落結構組成，因此酵母群落的時空演替貫穿于整個自然發酵食品發酵過程。酵母群落結構的時空演替不斷進行，使每次發酵后得到的產品質感完全不同。酵母群落結構決定了最終發酵食品的品質，因此對于不同發酵階段酵母群落時空演替的分析，以及酵母原位功能的分析，能夠使我們在系統的水平上對整個工藝進行優化和調控，并在發酵食品品質出現問題時對品質發生變化的原因進行分析。同時，認識微生物在自然釀造中的原位功能，對于在生產中去強化有用的功能菌株，對于提高白酒品質具有重要的意義。但是，目前沒有酵母原位功能分析的任何報道，目前認識酵母功能的方法主要通過菌株分離后逐一進行功能測定的方法盡管能初步認識菌株的功能，但是由于單一菌株培養條件無法完全模擬混合微生物自然發酵條件，所測定的體外功能與自然釀造體系中微生物的原位功能是不相同的，因此，這種錯誤的判斷使我們對微生物在生產中的功能會造成誤導，從而無法有效判定功能菌株，也無法有效應用功能菌株。

目前關于自然釀造體系中，如白酒中微生物的研究主要在分析微生物的菌群結構，例如，Xiao-Ran?Li等人使用ITS1區域的16S?rRNA基因克隆庫結合qPCR技術對汾酒釀造過程的微生物群落的時間演替進行了描述。但是，該文獻沒有提出方法對酵母群落演替模式進行深入分析尋找決定白酒品質的關鍵酵母。趙立平等人建立了一種工程化微生態系統運行狀態診斷方法，該方法比較正常系統與故障系統之間群落演替模式差別，找出了正常和故障系統中差異的微生物，但是通過簡單的比較正常系統與故障系統微生物組成的差別，無法判斷在自然原位發酵過程中不同微生物生成的揮發性產物對食品風味的影響。

本發明旨在提供一種適合于自然釀造體系中微生物原位功能的方法，利用原位的方法判定食品自然混合釀造體系中風味功能酵母。

發明內容

本發明的目的是提供一種原位判定混合釀造體系中風味功能微生物的方法。通過分析白酒發酵過程不同時間酵母群落及揮發性產物時空演替的差別，以及不同種類酵母與揮發性產物關系的確立，來確定白酒釀造微生態中關鍵優良酵母。

所述方法主要包括以下步驟：

（1）基于酵母26S?rDNA?D1/D2區PCR-DGGE指紋圖譜分析確定發酵過程酵母群落結構；

所述指紋圖譜分析是提取白酒釀造一輪次不同時間點的酒醅樣品中的基因組DNA，進行26S?rDNA?D1/D2區PCR，并通過DGGE指紋圖譜分析所有樣品的酵母群落結構；所述26S?rDNA?D1/D2區PCR分兩步，第一步PCR體系包括：引物NL1(5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’)和NL4（5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’）各6.25pmol，dNTP5mmol，模板DNA10ng，Taq?DNA聚合酶1U以及配套1×buffer及50mmol?MgCl₂；擴增程序為：94℃預變性3分鐘，然后94℃變性1分鐘，50℃退火2分鐘，72℃延伸1分鐘，共進行30個循環，最后72℃延伸10分鐘；采用UVI?band/map軟件對條帶的遷移位置和亮度進行分析。

所述的26S?rDNA?D1/D2區PCR擴增第二步反應體系如下：引物GC-NL1（5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCCATATCAATAAGC-3’）和LS2(5’-ATTCCCAAACAACTCGACTC-3”)各6.25pmol，dNTP5mmol，模板DNA10ng，Taq?DNA聚合酶1U以及配套1×buffer及50mmol?MgCl₂；擴增程序同第一步反應；采用UVIband/map軟件對條帶的遷移位置和亮度進行分析。

（2）通過主成分載量分析找到在群落演替中起著重要作用的DGGE條帶，鑒定其代表的酵母種群；